해양 샘플의 총 지질 및 지질 수업 결정
Summary
이 프로토콜은 해수 및 생물학적 표본에서 지질의 결정을 위한 것입니다. 여과류의 지질은 고체의 경우 클로로폼 또는 클로로폼및 메탄올혼합물로 추출됩니다. 지질 클래스는 화염 이온화 감지와 막대 얇은 층 크로마토그래피에 의해 측정되고 그들의 합계는 총 지질 함량을 제공합니다.
Abstract
지질은 주로 탄소와 수소로 구성되어 있으며, 따라서 바다에서 다른 유기 거대 분자보다 더 큰 특정 에너지를 제공합니다. 탄소와 수소가 풍부하기 때문에 소수성이며 유기 오염 물질용 용매 및 흡수 담체 역할을 할 수 있으므로 해양 생태계에서 오염 물질 바이오 축적의 원동력이 될 수 있습니다. 그들의 소수성 특성은 해수 또는 생물학적 표본에서 그들의 격리를 용이하게 합니다: 해양 지질 분석은 수생 매트릭스에 있는 그밖 물질에서 그들의 분리를 위한 편리한 방법을 제공하는 비 극성 유기 용매에 있는 샘플링 그리고 그 때 추출으로 시작됩니다.
해수를 샘플링한 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과에 의한 운영 정의된 ‘용해’와 ‘미립자’ 진영으로 분리하는 것을 포함합니다. 시료는 진정으로 용존된 물질과 콜로이드를 위해 일반적으로 클로로폼을 사용하여 시료 매트릭스로부터 분리된 지질을 수집하고, 고체 및 생물학적 표본을 위한 클로로폼과 메탄올의 혼합물을 포함한다. 이러한 추출 물 생물 발생 및 인위적 소스에서 여러 클래스를 포함 할 수 있습니다. 이때, 총 지질 및 지질 클래스가 결정될 수 있다. 총 지질은 관례적으로 구분된 개별적으로 결정된 지질 클래스를 합산하여 측정할 수 있습니다. 화염 이온화 검출(FID)을 가진 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 해양 샘플에서 지질의 정량적 분석에 정기적으로 사용됩니다. TLC-FID는 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하며, 클래스를 합산하여 총 지질 측정을 제공합니다.
지질 등급 정보는 지질 추출물에서 방출된 후 지방산 및/또는 스테롤과 같은 개별 성분의 측정과 결합될 때 특히 유용합니다. 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 인류학적 영향에 의해 영향의 정도를 평가 생태 및 생물 지질 연구에 광범위하게 사용 된다는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군 (예 : 아쿠아 피드 및 / 또는 먹이)에 식이 값의 물질을 측정하고 수질 (예 : 탄화수소)의 지표로 사용되었습니다.
Introduction
여기에 설명 된 방법은 해양 지질으로 작동적으로 정의 되는 물질에 관한. 이 정의는 비극성 유기 용매에서 액체 액체 추출에 대한 그들의 편의성을 기반으로하며 수중 매트릭스에서 다른 물질과 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 그들의 소수성 성질은 바닷물 또는 생물학 견본에서 그들의 격리를, 그들의 농축, 소금과 단백질의 제거를 촉진합니다.
지질 함량의 측정과 해양 생물의 구성은 수십 년 동안 식품 웹 생태학, 양식 영양 및 식품 과학에 큰 관심을 가지고 있습니다. 지질은 살아있는 유기체에 있는 보편적인 분대입니다, 세포막에 있는 필수적인 분자로 작동합니다, 생체 이용 가능한 에너지의 주요 근원으로, 단열 및 부력을 제공하고, 신호 분자로 봉사합니다. 다른 분야에서 지질 측정을 위한 절차가 잘 설명되었지만, 해양 샘플과의 사용은 일반적으로1형뿐만 아니라 현장 조건에 적응하기 위해 수정이 필요하다.
해수 샘플의 경우, 첫 번째 단계는 일반적으로 여과(프로토콜 단계 1)에 의해 작동적으로 정의된 ‘용해’와 ‘미립자’ 분획으로 분리가 필요합니다. 미립자 분획은 필터에 의해 유지되는 것이며, 모공의 크기는 컷오프2를정의하는 데 중요하다. 종종 미립자 물질을 샘플링할 때 지질 농도를 총 질량 농도에 관련시키고 자하며, 이 경우 별도의 더 작은 샘플(예: 10mL)을 이 목적을 위해 취해야 합니다(프로토콜 단계 1, 참고). 정확한 질량 결정을 얻으려면 여과 끝에 암모늄 포메이트 (35 g/L)를 추가하는 것이 중요합니다.
더 큰 시료로부터의 해수 여과는 시료 유형에 따라 250mL에서 1L 사이로 양해야 하며 분리 깔때기에서 액체 액체 추출을 받게 된다(프로토콜 단계 2). 지질의 소수성 성질은 클로로폼과 같은 비극성 용매에서 추출하여 다른 화합물과 분리될 수 있음을 의미한다. 2층 시스템은 지질이 유기 층으로 분할되는 반면 수용성 성분은 수성 층에 유지되도록 생성됩니다.
필터상 미립자 시료, 또는 생물학적 시편은 수정된 Folch 외. 추출3,또한 클로로폼(Protocol step 3)을 수반한다. 다시 말하지만, 유기/수성 시스템은 지질이 유기 상으로 분할되는 반면, 수용성 분자는 수성 상에 남아 있고 단백질이 침전됩니다. 사실, 고형물의 경우, 대부분의 실험실은 엽록소와 메탄올을 포함하는 Folch 외. 추출3 절차의 일부 변형을 사용합니다. 필터의 경우, 첫 번째 단계는 클로로폼 2mL 및 메탄올 1mL로 균질화하는 것입니다.
추출 하는 동안, 주의 화학 또는 효소 수정에서 지질을 보호 하기 위해, 에스 테르 결합 가수 분해 또는 탄소 탄소 이중 결합 산화를 줄이기 위해 얼음에 샘플 및 용매를 유지 하 여. 조직과 세포 지질은 천연 항산화제와 구획화4에의해 아주 잘 보호됩니다. 그러나, 시료의 균질화에 따라, 세포 내용물들은 지질을 더 변경, 화학적 또는 효소적으로 배치하는 렌더링을 결합한다. 대부분의 스테롤과 같은 일부 지질은 매우 안정적이며, 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질과 같은 지질은 화학 적 산화에 더 취약합니다. 이중 결합을 결합한 스테롤과 같은 다른 사람들은 빛5에의해 산화되는 경향이 있다. 추출 후 지질은 화학 적 산화에 훨씬 더 취약하며 샘플은 질소와 같은 불활성 가스 아래에 보관해야합니다. 질소의 부드러운 스트림은 또한 추출 물을 집중 하는 데 사용 됩니다.
농도 후, 지질은 일반적으로 대량으로 정량화 될 것 이다 그들은 높은 농도 의 에너지를 제공 하는 해양 생태계의 중요 한 구성 요소, 탄수화물과 단백질의 두 배 kJ/g 이상. 변함없이 그들은 다음 개별 구성 요소로 정량화 될 것 이다: 지질의 포괄적인 분석 일반적으로 간단한 범주로 분리 포함, 그들의 화학 적 특성에 따라. 따라서 전체 분석은 총 지질, 지질 클래스 및 개별 화합물을 측정하는 것을 포함합니다.
총 지질은 크로마토그래피6에의해 분리된 개별적으로 측정된 지질 클래스의 합을 취함으로써 결정될 수 있다. 해양 지질 추출물은 생생및 인위적 인 공급원으로부터 12 개 이상의 클래스를 포함 할 수 있습니다. 지질 구조의 다양한 구조의 개별 그룹을 결정하 여 많은 정보를 얻을 수 있습니다 의미. 지질 클래스는 개별적으로, 또는 특정 그룹에서, 유기체의 특정 유형의 존재를 신호하는 데 사용되었습니다, 뿐만 아니라 자신의 생리 상태 및 활동2. 그들은 또한 유기 물질의 기원의 지표로 사용 되었습니다., 용존 유기 물질을 포함 하 여 (DOM) 뿐만 아니라 소수성 오염 물질.
트리아실글리세롤, 인지질 및 스테롤은 더 중요한 생체 생성 지질 클래스 중 하나입니다. 처음 두 가지는 2개 또는 3개의 지방산이 에스테르화되는 글리세롤 백본을 소유하기 때문에 생화학적으로 관련되어있다(도 1). 트리아실글리세롤은 왁스 에스테르와 함께 매우 중요한 저장 물질이며, 다른 지방산 함유 지질 클래스는 투석기류, 자유 지방산 및 모노아실글리세롤과 같은 일반적으로 사소한 성분입니다. 불포화 지방산은독성이있을 수 있기 때문에 살아있는 유기체에서 낮은 농도로 존재한다. 스테롤 (그들의 자유롭고 에스테르 화 된 형태로 모두) 지방 알코올은 또한 덜 극성 지질 중 포함, 글리콜리피와 인지질은 극지 지질 동안. 극성 지질에는 세포막에서 발견되는 지질 이중층의 형성을 허용하는 친수성 그룹이 있습니다. 무료 스테롤은 또한 막 구조 성분이며 트리아실글리세롤에 대한 비율로 복용하면8에널리 사용된 상태 또는 영양 지수(TAG : ST)를 제공한다. 인지질(ST : PL)에 대한 비율로 복용하면 염에 대한 식물 민감도를 나타내는 데 사용할 수 있습니다: 높은 값은 구조적 무결성을 유지하고 멤브레인 투과성을 감소시킵니다9. 이 비율의 역 (PL : ST)은 온도 적응10동안 바이 밸브 조직에서 연구되었습니다.
해양 지질 클래스는 실리카 젤 코팅 막대(프로토콜 단계 4)의 얇은 층 크로마토그래피(TLC)로 분리한 다음 자동 FID 스캐너에서 화염 이온화 검출(FID)에 의해 검출및 정량화될 수 있다. TLC/FID는 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 데이터를 빠르게 제공하고 전체 지질에 대한 가치인 모든 클래스의 합을 취함으로써 해양 샘플에 일상적으로 사용되었습니다. TLC/FID는 품질 보증(QA) 평가를 받았으며 일관된 외부 교정, 낮은 블랭크 및 정밀 복제분석(11)에필요한 표준을 충족하는 것으로 나타났습니다. 변형계수(CV) 또는 상대적 표준 편차는 약 10%, FID 스캐너 총 지질 데이터는 일반적으로 중력 및 기타방법에의해 얻은 지질 데이터의 약 90%이다. 중력은 FID 스캐너가 비휘발성 화합물만을 측정하고, 또한 중력 측정에 비 지질 물질을 포함할 수 있기 때문에 더 높은 총 지질을 제공합니다.
지질 등급 분석에 의해 제공되는 정보는 개인, 또는 스테롤, 또는 조합에 있는 둘의 결정과 결합될 때 특히 유용합니다. 이러한 분석을 향한 첫 번째 단계는 지질 추출물의 스테롤과 함께 모든 성분 지방산의 방출을 포함한다 (프로토콜 단계 5). 지질 구조와 기능의 다양한 그들은 생태계 건강과 그들이 인류와 지상파 입력에 의해 영향을받은 정도를 평가하는 생태 및 생지구 화학 연구에서 광범위한 사용을 보았다 는 것을 의미한다. 그들은 해양 동물군뿐만 아니라 물 샘플의 품질을 나타내는 식이 값의 물질의 생합성을 측정하는 데 사용되었습니다. 퇴적물 코어 샘플에서 지질을 측정하면 육지-바다 마진 근처의 인간 토지 사용의 변화에 대한 퇴적물의 민감도를 보여주는 데 도움이 됩니다.
개별 지질 화합물을 식별하고 정량화하기 위한 주요 공구는 전통적으로 FID를 가진 가스 크로마토그래피 (GC)이었습니다. 그러나 분석하기 전에, 이러한 화합물은 파생에 의해 더 휘발성이 만들어집니다. 지방산은 아킬 지질클래스(도 1)로부터산성 촉매(H2SO4)의존재에서 방출된다. 유기 화학에서, 아실 군 (R-C=O)은 일반적으로 카복실산 (R-COOH)에서 파생됩니다. 그(것)들은 그 때 GC 열에 더 나은 분리를 주는 지방산 메틸 에스테르 (FAME)에 다시 에스테르 (프로토콜 단계 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
TLC-FID 시스템이 작은 샘플에서 시놉틱 지질 클래스 정보를 제공하는 속도는 TLC-FID를 해양 샘플을 선별할 수 있는 도구로 만들어 더 많은 관련 분석 절차를 착수합니다. 이러한 분석은 일반적으로 지질 추출물에서 성분 화합물의 방출을 필요로하고 가스 크로마토그래피의 경우 변동성을 증가. TLC-FID와 GC-FID가 결합된 것은 해산물 추출물 및 기타 식품14의추출물을 위한 강력한 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 C.C. Parrish에 105379 수의 보조금을 지원받았습니다. 메모리얼 대학의 핵심 연구 장비 및 악기 교육 (CREAIT) 네트워크는이 출판물에 자금을 지원했다.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
