海洋試料における総脂質および脂質クラスの決定
Summary
このプロトコルは、海水および生物学的標本中の脂質の決定のためのものです。濾液中の脂質は、固形物の場合にはクロロホルムまたはクロロホルムとメタノールの混合物で抽出される。脂質クラスは、炎イオン化検出を用いたロッド薄層クロマトグラフィーで測定され、その合計が総脂質含有量を示します。
Abstract
脂質は主に炭素と水素で構成されており、海の他の有機高分子よりも大きな特定のエネルギーを提供します。炭素と水素が豊富であることも疎水性であり、有機汚染物質の溶媒および吸収キャリアとして機能し、海洋生態系における汚染物質の生物蓄積の原動力となり得る。その疎水性は海水または生物学的標本からの隔離を促進する:海洋脂質分析は、非極性有機溶媒のサンプリングと抽出から始まり、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供する。
海水がサンプリングされた場合、最初のステップは通常、濾過によって操作的に定義された「溶解」および「粒子状」の派閥への分離を含む。サンプルを収集し、サンプルマトリックスから分離された脂質は、通常、真に溶解した物質とコロイドのためのクロロホルムで、固体および生物学的標本のためのクロロホルムとメタノールの混合物で分離される。このような抽出物は、バイオジェニックおよび人為的な情報源からのいくつかのクラスを含んでいてもよい。このとき、総脂質及び脂質クラスが決定され得る。全脂質は、慣習的にクロマトグラメン的に分離された個別に決定された脂質クラスを合計することによって測定することができる。薄層クロマトグラフィー (TLC) と火イオン化検出 (FID) は、海洋試料からの脂質の定量分析に定期的に使用されています。TLC-FIDは、シノプティック脂質クラス情報を提供し、合計クラスにより、総脂質測定を行います。
脂質クラス情報は、脂質抽出物からの放出後に、個々の成分、例えば脂肪酸および/またはステロールの測定値と組み合わせる場合に特に有用である。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康と人類起源の影響による影響度を評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相(例えば、水飼料および/または獲物)に対する食事価値の物質を測定し、水質(例えば炭化水素)の指標として使用されてきた。
Introduction
ここで説明する方法は、海洋脂質として運用上定義される物質に関するものです。この定義は、非極性有機溶媒中の液体-液体抽出に対する無邪気さに基づいており、水生マトリックス内の他の物質から分離するための便利な方法を提供します。その疎水性は海水や生物学的標本からの隔離、濃縮、塩やタンパク質の除去を促進します。
海洋生物における脂質含有量の測定と構成は、食品ウェブ生態学、養殖栄養学、食品科学に何十年も関心を集めてきました。脂質は、生体内の普遍的な構成要素であり、細胞膜に不可欠な分子として作用し、生体利用エネルギーの主要な供給源として、断熱性および浮力を提供し、シグナル伝達分子として機能する。他の分野における脂質決定の手順はよく説明されているが、海洋サンプルでのそれらの使用は、一般に、試料タイプ1だけでなく、フィールド条件に適応するための修飾を必要とする。
海水サンプルの場合、最初のステップは通常、通常、濾過によって、操作的に定義された「溶解」および「微粒子」分数に分離する必要があります(プロトコルステップ1)。粒子状分率は、フィルターによって保持されるものであり、そして、細孔のサイズは、カットオフ2を定義する上で重要である。多くの場合、粒子状物質をサンプリングする際には、脂質濃度を総質量濃度に関連付けたいが、その場合は別の小さなサンプル(例えば、10mL)をこの目的のために採取しなければならない(プロトコルステップ1、注)。正確な質量決定を得るためには、濾過の終わりにアンモニウムのギマ質(35 g/L)を加えることを重要である。
大きいサンプルからの海水の濾液は、サンプルの種類に応じて250mLと1Lの間に量り、セパレート漏斗で液体液体抽出を行う必要があります(プロトコルステップ2)。脂質の疎水性の性質は、クロロホルムなどの非極性溶媒で抽出することによって他の化合物から分離できることを意味する。2層システムは、水溶性成分が水層に留まる間、脂質が有機層に分け込む場所に作成されます。
フィルター上の粒子状サンプル、または生物学的標本は、クロロホルムを含む改変Folchら抽出3で抽出される(プロトコルステップ3)。再び、脂質が有機相に分かれ、水溶性分子が水相に残り、タンパク質が沈殿する有機/水系が作られます。実際、固体の場合、ほとんどの実験室は、クロロホルムおよびメタノールを含むFolchら抽出3 手順のいくつかのバリエーションを使用する。フィルターの場合、最初のステップは、2 mLのクロロホルムと1 mLのメタノールで均質化することです。
抽出中は、エステル結合加水分解や炭素炭素二重結合酸化を減らすために氷上にサンプルや溶媒を保持することによって、化学的または酵素的修飾から脂質を保護するために注意する必要があります。組織および細胞脂質は、天然の抗酸化物質によって、そして区画化4によってかなりよく保護されている。しかし、サンプルの均質化に続いて、細胞内容物は、化学的または酵素的に、より変化するために配置された脂質をレンダリングして結合される。ほとんどのステロールのようないくつかの脂質は非常に安定であり、多価不飽和脂肪酸を含むものは化学的酸化の影響を受けやすいものもある。他の他の,二重結合を伴うステロールのような,光5によって触媒される酸化を起こしやすい。抽出後、脂質は化学酸化の影響を受けやすく、サンプルは窒素などの不活性ガスの下に保管する必要があります。窒素の穏やかな流れはまた、抽出物を濃縮するために使用されます。
濃度の後、脂質は通常、炭水化物やタンパク質のkJ/gの2倍以上の高濃度エネルギーを提供する海洋生態系の重要な構成要素であるため、一括で定量化されます。脂質の包括的な分析は、一般的に、その化学的性質に応じて、より単純なカテゴリに分離することを含む:彼らは常に個々の成分として定量化されます。したがって、完全な分析は、総脂質、脂質クラスおよび個々の化合物を測定することを含む。
全脂質は、クロマトグラフィー6で分離された個別に測定された脂質クラスの合計を取ることによって決定することができる。海洋脂質抽出物は、生物起源および人為的な情報源から12以上のクラスを含んでいてもよい。脂質構造の多種多様は、構造の個々のグループを決定することによって多くの情報を得ることができることを意味します。脂質クラスは、個々に、または特定のグループにおいて、特定の種類の生物の存在を知らせるために使用されてきただけでなく、それらの生理学的状態および活性2。また、溶存有機物(DOM)や疎水性汚染物質を含む有機材料の起源の指標としても使用されています。
トリアシルグリセロール、リン脂質およびステロールは、より重要なバイオジェニック脂質クラスの一つです。最初の2つは、2~3種類の脂肪酸がエステル化されるグリセロール骨格を有するので生化学的に関連している(図1)。トリアシルグリセロールは、ワックスエステルとともに非常に重要な貯蔵物質であり、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸、モノアシルグリセロールなどの他の脂肪酸含有脂質クラスは、一般的にマイナーな成分である。遊離脂肪酸は生物の低濃度で存在し、不飽和脂肪酸は毒性7であり得る。ステロール(自由およびエステル化された形態の両方)および脂肪アルコールは、より少ない極性脂質の中に含まれ、糖脂質およびリン脂質は極性脂質である。極性脂質は、細胞膜に見られる脂質二重層の形成を可能にする親水性基を有する。遊離ステロールは膜構造成分も、トリアシルグリセロールに対する比率で取られた場合、それらは、広く使用されている条件または栄養指数(TAG:ST)8を提供する。リン脂質に対する比率(ST:PL)を摂取すると、塩に対する植物感受性を示すために使用され得る:より高い値は構造的完全性を維持し、膜透過性を低下させる9。この比の逆(PL:ST)は、温度適合10の間に二枚貝組織で研究されている。
海洋脂質クラスは、シリカゲルコーティングロッド上の薄層クロマトグラフィー(TLC)で分離することができ(プロトコルステップ4)、自動FIDスキャナで炎イオン検出(FID)によって検出および定量化されます。TLC/FIDは、小さなサンプルからシノプティック脂質クラスデータを迅速に提供し、全クラスの合計を取ることによって、総脂質の値を取得する海洋サンプルに日常的に使用されるようになってきた。TLC/FIDは品質保証(QA)評価を受けており、一貫した外部キャリブレーション、低ブランク、および正確な複製分析11に必要な基準を満たすことが判明した。変動係数(CV)または相対標準偏差は約10%であり、FIDスキャナ総脂質データは、通常、重量測定および他の方法2で得られたデータの約90%である。重量測定は、FIDスキャナが非揮発性化合物のみを測定し、また重量測定に非脂質物質を含む可能性のある結果として、より高い総脂質を与える可能性が高い。
脂質クラス分析によって提供される情報は、脂肪酸を個体として、ステロール、または2つを組み合わせて組み合わせた場合に特に有用である。これらの分析に向けた最初のステップは、脂質抽出物中のステロールと一緒にすべての成分脂肪酸の放出を含む(プロトコルステップ5)。脂質の構造と機能の多種多様は、生態系の健康とそれらが人類起源および地上の入力によってどの程度影響を受けているかを評価する生態学的および生物地球化学的研究で広く使用されていることを意味します。これらは、海洋動物相に対する食事価値の物質の生合成を測定し、水のサンプルの品質を示すために使用されています。堆積物コアサンプルの脂質を測定することは、陸海の近くの人間の土地利用の変化に対する堆積物の感受性を示すのに役立ちます。
個々の脂質化合物を同定・定量するための主要なツールは、従来、FIDを有するガスクロマトグラフィー(GC)であった。しかし、分析の前に、これらの化合物は誘導体化によってより揮発性に作られる。脂肪酸は、アシル脂質クラスから酸性触媒(H2SO4)の存在下で放出される(図1)。有機化学では、アシル基(R-C=O)は、通常カルボン酸(R-COOH)に由来する。その後、GCカラム上でより良い分離を与える脂肪酸メチルエステル(FAME)に再エステル化されます(プロトコルステップ5)。
Protocol
Representative Results
Discussion
TLC-FIDシステムが小さいサンプルからのシノプティック脂質クラス情報を提供する速度は、TLC-FIDを海洋サンプルをスクリーニングするためのより複雑な分析手順を行う前に可能なツールにする。このような分析は、通常、ガスクロマトグラフィーの場合の揮発性を高めるために脂質抽出物および誘導体化からの成分化合物の放出を必要とする。GC-FIDと組み合わせたTLC-FIDは、魚介類および他の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がC.Cパリッシュに105379助成金を提供しました。メモリアル大学のコア研究機器&インストゥルメントトレーニング(CREAIT)ネットワークは、この出版物に資金を提供しました。
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
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