Summary
يمكن استخدام العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA) لتحديد البروتينات ملزمة ليغاند الصغيرة من كائن حي باستخدام مكتبة ORFeome.
Abstract
شهد العقد الماضي تقدما هائلا في فهم جزيئات الإشارات الصغيرة في فسيولوجيا البكتيريا. وعلى وجه الخصوص، تم تحديد البروتينات المستهدفة للعديد من الرسل الثانويين المشتقة من النيوكليوتيدات (NSMs) بشكل منهجي ودراسة في الكائنات الحية النموذجية. ويعزى هذا الإنجاز أساسا إلى تطوير العديد من التقنيات الجديدة بما في ذلك تقنية مركب التقاط والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)، والتي استخدمت لتحديد البروتينات المستهدفة بشكل منهجي من هذه الجزيئات الصغيرة. تصف هذه الورقة استخدام NSMs، وبانتوسين بنتا- و tetraphosphates (p)ppGpp، كمثال ومظاهرة فيديو لتقنية DRaCALA. باستخدام DRaCALA، تم تحديد 9 من أصل 20 البروتينات المستهدفة المعروفة و 12 من (ع) ppGpp في الكائن الحي النموذجي، Escherichia القولونية K-12، مما يدل على قوة هذا المقايسة. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام DRaCALA لدراسة الليغندات الصغيرة التي يمكن تصنيفها بالنظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية. تتم مناقشة الخطوات الحاسمة والايجابيات والسلبيات من DRaCALA هنا لمزيد من التطبيق لهذه التقنية.
Introduction
البكتيريا استخدام عدة جزيئات الإشارات الصغيرة للتكيف مع بيئات المتغيرة باستمرار1،2. على سبيل المثال، فإن الحثات الذاتية، N-acylhomoserine lactones وoligopeptides المعدلة، والتوسط في الاتصالات بين الخلايا بين البكتيريا لتنسيق السلوك السكاني، وهي ظاهرة تعرف باسم استشعار النصابالقانوني 2. مجموعة أخرى من جزيئات الإشارات الصغيرة هي NSMs ، بما في ذلك الأدينوسين الدوري الذي تمت دراسته على نطاق واسع أحادي الفوسفات (cAMP) ، ودي أمبير الدوري ، والفوسفات الأحادي الدوري دي جوانوسين (الدوري دي GMP) ، وغوانوزين بنتا - وتترا فوسفات (p)ppGpp1. البكتيريا تنتج هذه NSMs كاستجابة لمجموعة متنوعة من ظروف الإجهاد المختلفة. بمجرد إنتاجها ، ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة وتنظم العديد من المسارات الفسيولوجية والأيضية المختلفة للتعامل مع الضغوط التي تواجهها وتعزيز البقاء البكتيري. لذلك ، فإن تحديد البروتينات المستهدفة هو شرط أساسي لا مفر منه لفك الرموز الوظائف الجزيئية لهذه الجزيئات الصغيرة.
وقد شهد العقد الماضي طفرة في المعرفة بهذه الجزيئات الصغيرة التي تشير إلى ذلك، ويرجع ذلك أساسا إلى العديد من الابتكارات التقنية التي كشفت عن البروتينات المستهدفة لهذه الجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه تقنية مركب التقاط3،4،5، والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)6 لمناقشتها في هذه الورقة.
اخترعها فنسنت لي وزملاء العمل في 20116, DRaCALA تنشر قدرة غشاء النيتروسليلوز لعزل التفاضلية الحرة والبروتين ملزمة ligands. جزيئات مثل البروتينات لا يمكن أن تنتشر على غشاء النيتروسليلوز، في حين أن الليغنديات الصغيرة، مثل NSMs، قادرة على. عن طريق خلط NSM(على سبيل المثال، ppGpp) مع البروتين لاختبارها واكتشافها على الغشاء ، يمكن توقع سيناريوهين(الشكل 1):إذا (ع) ppGpp يربط البروتين ، سيتم الاحتفاظ بالعلامات المشعة (p) ppGpp في وسط البقعة بواسطة البروتين ولن ينتشر إلى الخارج ، مما يعطي نقطة صغيرة مكثفة (أي، إشارة مشعة قوية) تحت الفوسفوريماجر. ومع ذلك، إذا (ع)ppGpp لا يرتبط البروتين، وسوف تنتشر بحرية إلى الخارج لإنتاج بقعة كبيرة مع إشارة مشعة خلفية موحدة.
وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن DRaCALA التفاعل بين جزيء صغير وبروتين غير مبور في lysate خلية كاملة إذا كان البروتين موجود في كمية كافية. هذه البساطة تسمح باستخدام DRaCALA في تحديد أهداف البروتين بسرعة باستخدام مكتبة التعبير ORFeome. في الواقع، البروتينات المستهدفة من cAMP7، دوري دي AMP8، دوري دي GMP9،10، و (ع) ppGpp11،12،13 وقد تم تحديد منهجي باستخدام DRaCALA. تستخدم هذه المقالة الفيديو (p)ppGpp كمثال على إظهار ووصف الخطوات والاعتبارات الهامة في إجراء فحص DRaCALA ناجحة. ملاحظة، ينصح بشدة وصف أكثر شمولا من DRaCALA14 لقراءة بالاشتراك مع هذه المقالة قبل تنفيذ DRaCALA.
الشكل 1: مبدأ DRaCALA. (أ) التخطيطي للدراكالا المقايسة. راجع النص للحصول على التفاصيل. (ب)تحديد وحساب الكسر الملزم. راجع النص للحصول على التفاصيل. باختصار، سيتم تحليل البقع DRaCALA عن طريق رسم دائرتين التي تحد من بقعة كاملة والنقطة المظلمة الداخلية(أي.،وتحتفظ (ع) ppGpp بسبب ربط البروتين اختبارها). إشارة الربط المحددة هي الإشارة المشعة للدائرة الداخلية (S1) بعد طرح إشارة الخلفية غير المحددة (محسوبة ب A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)). الكسر الملزم هو إشارة الربط المحددة مقسومة على إجمالي الإشارة المشعة (S2). المختصرات: DRaCALA = العمل الشعيرات الشعرية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند; (ع) ppGpp = جوانوسين بنتا - وتيترافوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد lysates الخلية بأكملها
- تلقيح E. coli K-12 ASKA ORFeome جمعسلالات 15 إلى 1.5 مل مرق ليسوجيني (LB) التي تحتوي على 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 96 جيدا لوحات الآبار العميقة. تنمو بين عشية وضحاها (O / N) لمدة 18 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 160 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، أضف الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوغالاكتوبترانوزيد (IPTG) (0.5 مليون متر نهائي) إلى ثقافات O/N للحث على التعبير عن البروتين عند 30 درجة مئوية لمدة 6 ساعة.
- الكريات الخلايا في 500 × ز لمدة 10 دقيقة. تجميد الكريات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تحلل الخلايا، إضافة 150 ميكرولتر من تحلل العازلة L1 (40 mM تريس درجة الحموضة 7.5، 100 م م كلوريد كلوريد، 10 مللي متر ملغم2،تكملها 2 mM فلوريد الفينيلميل سلفونيل (PMSF)، 40 ميكروغرام/ مل DNase 1، و 0.5 ملغم/ مل ليسوزيم) لإعادة إنفاق بيليه.
- تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم إذابة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر هذه الدورة ثلاث مرات لليس الخلايا. تخزين lysates في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. تنقية ريلseq و GppA
ملاحظة: تستخدم البروتينات المؤتلفة Relseq من العقدية equisimilis وGppA من E. coli K-12 لتجميع pppGpp وppGpp ذات العلامات المشعة، على التوالي.
- تنمو وجمع الخلايا التعبير عن كل بروتين.
- تنمو سلالة E. coli BL21 DE3 تصل إلى مرحلة الأسي (الكثافة البصرية (OD) ~ 0.3-0.4) في مرق LB، وتدور أسفل 1 مل من الثقافة في 6000 × ز لمدة 5 دقائق. Decant supernatant، وإعادة إنفاق الخلايا مع 100 ميكرولتر من مرق TSB الجليد الباردة (LB مرق تكملها مع 0.1 غرام/مل PEG3350، 0.05 مل / مل ديميثيل سلف أكسيد، 20 مللي متر ملغكل2).
- مزيج البلازميدات التي تحمل الهستيدين الموسومة relseq و gppA، كل 100 نانوغرام ، مع تعليق الخلية أعلاه في TSB ، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. الحرارة صدمة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 40 s. ضع الخليط على الثلج لمدة دقيقتين، وأضف 1 مل من مرق LB في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا بالتعافي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الهياج عند 160 دورة في الدقيقة.
- لوحة الخلايا المستردة على لوحات أجار LB تكملهاالمضادات الحيوية المقابلة (ريل seq:100 ميكروغرام / مل أمبيسلين; GppA: 30 ميكروغرام / مل كاناميسين). في اليوم التالي، تلقيح المستعمرات في مرق LB لبدء O / N الثقافات المسبقة لكلا النوعين في 37 درجة مئوية.
- بعد 18 ساعة، تلقيح 500 مل من LB المتوسطة مع 10 مل من الثقافات O / N والمضادات الحيوية المقابلة. تنمو الثقافات عن طريق اهتزاز في 160 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية. عندما يصل OD600nm 0.5-0.7، حث التعبير البروتين بإضافة 0.5 M IPTG وتنمو لمدة 3 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 160 دورة في الدقيقة.
- جمع الخلايا عن طريق الغزل في 6084 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. Resuspend بيليه في 20 مل من الجليد الباردة 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، وإعادة الطرد المركزي في 1912 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. decant supernatant، وتجميد الكريات في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- تنقية حمض النيكل والنتريلوترياستيك (Ni-NTA)
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، تأكد من أن العينات الباردة.- إضافة 40 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة L2 (50 mM تريس pH 7.5, 150 mM NaCl, 5٪ الجلسرين, 10 mM imidazole, 10 mM β ميركابتوثانول تكملها مثبطات البروتيز (قرص خالية من EDTA; انظر جدول المواد) لإعادة إنفاق بيليه. Lyse الخلايا عن طريق سونيكيشن (60٪ السعة، 2 ق ON / 4 ق OFF لمدة 8 دقائق ON). مسح lysate عن طريق الغزل في 23426 × ز لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية ، والاستمرار مع supernatant لتنقية.
- أثناء الطرد المركزي أعلاه، وإعداد راتنج ني-NTA.
- نقل 500 ميكرولتر من راتنج ني-NTA المتجانس إلى عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين الدائمة، والسماح لها تسوية لمدة 15 دقيقة واستنزاف حل التخزين من خلال. غسل الراتنج مع 15 مل من المياه فائقة الشراء مرتين، ومن ثم غسل العمود مع 15 مل من تحلل العازلة L2.
- تحميل supernatant مسح الخلية lysate من الخطوة 1 على العمود، والسماح لها بالتدفق من خلال. غسل العمود مع 30 مل من العازلة الغسيل (50 mM تريس pH 7.5, 150 mM NaCl, 5٪ الجلسرين, 20 mM imidazole).
- Elute البروتينات مع 400 ميكرولتر من العازلة elution (50 mM تريس درجة الحموضة 7.5، 150 م م NaCl، 5٪ الجلسرين، 500 mM imidazole) ثلاث مرات. ثم كرر elution مع آخر 300 μL من المخزن المؤقت elution. الجمع بين البروتينات الملوتة إلى حجم نهائي من 700 ميكرولتر.
- الترشيح هلام
- إعداد هلام الترشيح العازلة (50 mM تريس, pH 7.5; 200 mM NaCl; 5٪ الجلسرين). اغسل عمود استبعاد الحجم بحجم عمود واحد (25 مل) من المخزن المؤقت لترشيح الجل.
- قم بتحميل العينة أعلاه 700 ميكرولتر باستخدام حلقة 500 ميكرولتر، وتشغيلها بمعدل 0.5 مل/دقيقة، وجمع 2-3 كسور، كل منها بحجم 0.5 مل، تحتوي على البروتينات المعنية.
- الجمع بين وتركيز الكسور التي تحتوي على كل من البروتينات باستخدام عمود تدور، وقياس تركيز البروتين باستخدام المقايسة برادفورد.
3. توليف 32P-المسمى pppGpp وppGpp
- تجميع رد فعل على نطاق صغير Relseq في أنبوب غطاء المسمار (انظر الجدول 1).
ملاحظة: العمل مع الكواشف المشعة فقط في مكان مرخص ومع معدات الحماية الشخصية.
| حجم الصوت (ميكرولتر) | ||
| نطاق صغير | نطاق واسع | |
| المياه فائقة البور | ||
| 10x ريلseq العازلة * | 2 | 50 |
| ATP (نهائي 8 mM) | ||
| ريلسيك (4 μم النهائي) | ||
| 32 P-α-جوانوسين ثلاثي الفوسفات (GTP) (النهائي 120 nM) (تحذير) | 0.2 | 5 |
| مجموع | 20 | 500 |
الجدول 1: تجميع المعلومات لتفاعلات توليف صغيرة وكبيرة النطاق من 32P-المسمى pppGpp. * 10x Relseq العازلة يحتوي على 250 mM تريس-HCl، درجة الحموضة 8.6؛ 1M NaCl; 80 م م2. اختصار: pppGpp = جوانوسين بنتافوسفات.
- احتضان أنبوب في 37 درجة مئوية في thermomixer لمدة 1 ساعة، ثم في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ووضعها على الجليد لمدة 5 دقائق. تدور أسفل البروتين عجلت في 15700 س ز لمدة 5 دقائق، ونقل supernatant (توليفها 32P-pppGpp) إلى أنبوب غطاء المسمار الجديد.
- لتجميع 32P-ppGpp من 32P-pppGpp، نقل نصف المنتج 32ف pppGpp إلى أنبوب غطاء المسمار الجديد، وإضافة 1 ميكرومتر GppA. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومن ثم وضعها على الجليد لمدة 5 دقائق.
- تدور أسفل البروتين عجلت في 15700 × ز لمدة 5 دقائق، ونقل supernatant (توليفها 32P-ppGpp) إلى أنبوب غطاء المسمار الجديد.
- تحليل 32P-pppGpp و 32P-ppGpp عن طريق تشغيل 1 ميكرولتر من العينات على طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC) لوحة (البولي ايثيلينين تعديل السليلوز TLC لوحات) باستخدام 1.5 M KH2PO4, pH 3.4, كمرحلة متنقلة.
ملاحظة: استخدامα-32P-المسمى جوانوسين 5'-ثلاثي الفوسفات(32ف-α-GTP) كعنصر تحكم. - جفف لوحة TLC تماما، ضعها بين مجلد بلاستيكي شفاف، وعرضها لشاشة تخزين فوسفور لمدة 5 دقائق. تصور وقياس الإشارات باستخدام الفوسفوريماجر.
ملاحظة: عندما نسب 32P-pppGpp و 32P-ppGpp أعلى من 85٪, رد فعل واسع النطاق (500 ميكرولتر, كافية لفحص 20 لوحات 96-جيدا) يمكن تجميعها وتوليفها باستخدام الجدول 1.
4. فحص DRaCALA من البروتينات المستهدفة من (ع) ppGpp
- ذوبان ونقل 20 ميكرولتر من lysates الخلية بأكملها إلى لوحة 96 جيدا V-أسفل microtiter. إضافة 2.5 U/ بئر من الإندونوكليا من Serratia marcescens، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحد من لزوجة ليسات. ضع الlysates على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- امزج 32P-pppGpp و 32P-ppGpp بنسبة 1:1، وأضف 1x تحلل العازل L1 لجعل التركيز النهائي ل (p)ppGpp يساوي 4 nM.
ملاحظة: نظرا للتشابه الكيميائي بين pppGpp وppGpp، فإن مزيجا من المادتين الكيميائيتين سيبسط عملية الفحص. - استخدام ماصة متعددة القنوات ونصائح ماصة المصفاة لإضافة وخلط 10 ميكرولتر من خليط (ع) ppGpp مع lysate الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- اغسل أداة 96 × دبوس عن طريق وضع محلول 0.01٪ من المنظفات غير الأيونية لمدة 30 s ، وجفف على ورق الأنسجة لمدة 30 s. كرر غسل أداة دبوس 3x.
- ضع أداة الدبوس في لوحات العينة أعلاه 96-well، وانتظر لمدة 30 s. رفع أداة دبوس على التوالي، ووضعه مباشرة إلى أسفل على غشاء النيتروسليلوز لمدة 30 s.
ملاحظة: إذا كان هناك بقعة مفقودة، بقعة 2 ميكرولتر من العينات المقابلة مع ماصة ونصائح تصفيتها. من المستحسن أن تجعل بقعة مكررة من نفس العينة كما هو مبين أدناه. - جفف الغشاء لمدة 5 دقائق في RT. ضع الغشاء بين مجلد بلاستيكي شفاف، وعرضه لشاشة الفوسفور التخزين لمدة 5 دقائق. تصور باستخدام الفوسفوريماجر.
5. تحديد وتحديد البروتينات المستهدفة المحتملة
- استخدم برنامج التحليل المرتبط بفوسفوريماجر لفتح ملف .gel للوحات المرئية. استخدم دالة تحليل Array لتعريف البقع 96 بإعداد شبكة من 12 عمودا × 8 صفوف.
- حدد دوائر كبيرة لتحديد الحافة الخارجية للبقع بأكملها (انظر الشكل 1B). تصدير Volumn + الخلفية والمنطقة من الدوائر الكبيرة المحددة ، وحفظ في جدول البيانات.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتغيير موضع كل دائرة على حدة لتتداخل تماما مع البقع، ثم قم بتغيير حجم كل دائرة على حدة لجعلها أكبر قليلا من البقعة الفعلية. - الحجم أسفل الدوائر المحددة للحد من النقاط الداخلية الصغيرة. تصدير Volumn + الخلفية، ومساحة الدوائر الصغيرة المعرفة ، وحفظ في جدول بيانات.
- حساب الكسور الربط في جدول البيانات باستخدام المعادلة في الشكل 1B، ورسم البيانات. تحديد البروتينات الملزمة المحتملة في الآبار التي تظهر كسورا عالية الربط بالمقارنة مع غالبية الآبار الأخرى.
الشكل 2:سير العمل العام لعملية فحص DRaCALA. يتم حث إنتاج البروتين من مجموعة إسكشيا القولونية، ويتم التخلص من الخلايا. وفي الوقت نفسه، يتم تنقية البروتينات المؤتلفة Relseq-His و GppA-His واستخدامها لتجميع 32pppGpp وppGpp المسمى P من 32P-α-GTP. ثم يتم خلط جزيئات ppGpp المسماة إشعاعيا (p) مع الليسات ، ويتم استخدام أداة دبوس 96 لاكتشاف الخلائط على غشاء النيتروسليلوز للتعرض اللاحق لشاشة تخزين الفوسفور والتصوير وتحديد كمي للإشارات المشعة. المختصرات: DRaCALA = العمل الشعيرات الشعرية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند; (ع) ppGpp = جوانوسين بنتا - وتيترافوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة. IPTG = ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالاتوبيرانوزيد; GTP = جوانوسين 5'-ثلاثي الفوسفات; SDS-PAGE = دودسيلسلفيت الصوديوم-البولي أكريلاميد هلام الكهربائي; TLC = طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باتباع البروتوكول المذكور أعلاه سوف تسفر عادة نوعين من النتائج (الشكل 3).
ويبين الشكل 3 ألف لوحة ذات إشارات ربط خلفية منخفضة نسبيا (كسور ملزمة < 0.025) من غالبية الآبار. إشارة الربط الإيجابية من بئر H3 يعطي جزء ملزم من ~ 0.35 وهذا هو أعلى بكثير من تلك التي لوحظت لل آبار أخرى. حتى من دون تحديد كمي، حسنا H3 لافت للنظر، مما يشير إلى أن البروتين المستهدف أعرب في H3 جيدا يربط إما pppGpp، ppGpp، أو كليهما. في الواقع، البروتين مفرط التعبير في H3 جيدا هو الفوسفوريفوسيل ترانسفيراسي hypoxanthine Hpt، والذي هو معروف لربط (ع) ppGpp12،16.
الشكل 3: لوحات فحص DRaCALA التمثيلية (إلى اليسار) والتحديد الكمي (إلى اليمين). (A) بقع DRaCALA من لوحة ASKA-50. الضربة الإيجابية الوحيدة ، Hpt ، أعطت إشارة ربط قوية تبرز في كل من البقعة ومخطط الكمية. (B, C) اثنين من البقع DRaCALA تكرار لوحة إعادة ترتيبها 31. تشير الدوائر والسهام السوداء المكسورة إلى البروتينات المستهدفة الحقيقية ل (p)ppGpp ، في حين تشير الدوائر الحمراء المكسورة إلى الإيجابيات الزائفة. راجع النص للحصول على التفاصيل. المختصرات: DRaCALA = العمل الشعيرات الشعرية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند; (ع) ppGpp = جوانوسين بنتا - وتيترافوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة. IPTG = ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالاتوبيرانوزيد; GTP = جوانوسين 5'-ثلاثي الفوسفات; SDS-PAGE = دودسيلسلفيت الصوديوم-البولي أكريلاميد هلام الكهربائي; TLC = طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا؛ Hpt = هيبو أكسانثين فوسفوريبوسيل ترانسفيراز; PrfC = الببتيد سلسلة الافراج عن عامل RF3; NadR = NMN أدينيليلترانسفيراسي; HflX = GTPase الترجمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تظهر النتيجة النموذجية الأخرى للفحص في الشكل 3B، C. في هذه اللوحة، أظهرت عدة آبار إشارات ربط خلفية أعلى نسبيا من تلك الموجودة في الشكل 3A. هذا واضح للعيان من النقاط الداخلية القوية نسبيا للعديد من الآبار. كما أظهر القياس الكمي أن العديد من الآبار لها كسور ملزمة في نطاق 0.02-0.04. ومن المرجح أن يكون سبب خلفية أعلى من إشارة ملزمة من قبل lysate الخلية بأكملها يجري لزجة على الرغم من العلاجات مع كل من DNase I و endonuclease من S. marcescens, التي تتحلل الحمض النووي الكروموسومي صدر. بالنسبة للوحات مثل هذه، من المهم مقارنة بقعتين متماثلتين من اللوحة (الخطوة 4.5؛ الخطوة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4.5؛ اللوحة 4 الشكل 3B، جيم). يظهر القياس الكمي لكلا اللوحتين أن الأهداف الإيجابية الأصيلة (الدوائر السوداء ، الآبار A10 PrfC ، B11 NadR) تميل إلى إعطاء كسور ملزمة عالية باستمرار.
وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأهداف الحقيقية يمكن أن تعطي أيضا كسور ملزمة متغيرة (حسنا D5، HflX12)مثل الإيجابيات كاذبة (الدوائر الحمراء). والسبب في هذا التباين يكمن في حقيقة أن لا يتم التعبير عن جميع البروتينات في مكتبة في شكل قابل للذوبان وبكميات المطلوبة. إذا كان تركيز البروتين قريبا من قيمة Kd أو أقل منها بقليل، يمكن توقع نتائج ربط متغيرة، حتى بالنسبة للأهداف الحقيقية. في الواقع، لم يتم الحصول على كميات كبيرة من البروتين HflX قابلة للذوبان من سلالة ASKA12. لتحديد ما إذا كانت هذه البروتينات هي الموثقات الحقيقية أم لا، يجب تنقية البروتينات المحتملة إلى التجانس والربط المؤكد باستخدام تركيز أعلى (50-100 ميكرومتر) من البروتينات.
من خلال هذا الفحص، تم تحديد 9 من أصل 20 بروتينا مستهدفا معروفا من (p)ppGpp12 (انظر قسم المناقشة)، مما يتحقق من فائدة DRaCALA لهذه المهمة. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف 12 هدفا جديدا من (ع) ppGpp وأكد ، مما يدل على أن DRaCALA هو تقنية قوية للكشف عن البروتينات المستهدفة الجديدة من (ع) ppGpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واحدة من الخطوات الحاسمة في أداء فحص DRaCALA هو الحصول على lysates خلية كاملة جيدة. أولا، ينبغي إنتاج البروتينات المختبرة بكميات كبيرة وفي أشكال قابلة للذوبان. ثانيا، يجب أن يكون تحلل الخلايا كاملا، ويجب أن تكون لزوجة التحلل ضئيلة. إدراج lysozyme واستخدام ثلاث دورات من تجميد ذوبان غالبا ما تكون كافية للخلايا lyse تماما. ومع ذلك، فإن الحمض النووي الكروموسومي الصادر يجعل اللزوجة الليسات ويولد إشارة ربط خلفية عالية، مما يؤدي إلى إيجابيات كاذبة كما هو موضح في الشكل 3B، C. وللتخفيف من ذلك، يمكن استخدام DNase 1 و/أو الإندونوكليا من S. marcescens، ويمكن احتضان العينات لفترة أطول لإضعاف الحمض النووي.
يجب استخدام كل من الضوابط السلبية (ناقلات البلازميد الفارغة) والضوابط الإيجابية (البروتين المستهدف المعروف) لتحسين الظروف لإعداد lysate الخلية بأكملها و المقايسة الملزمة DRaCALA قبل إجراء فحص واسع النطاق. عندما يتم العثور على مثل هذه الحالة المثلى، يصبح من غير الضروري إدراج عناصر التحكم في الفحص الفعلي لكل لوحة. وذلك لأن إجراء الفحص قصير جدا ولأن غالبية البروتينات في لوحة من المتوقع أن لا ترتبط (ع) ppGpp. لذلك، هذه البروتينات بمثابة ضوابط سلبية عند تحديد الكسور ملزمة(الشكل 3).
إنتاج أنقى 32P المسمى pppGpp وppGpp ضروري أيضا لفحص DRaCALA. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف نسبة التحويل من GTP إلى pppGpp. وبالتالي، من المهم تحسين درجة الحموضة، وتركيزات المغنيسيوم والإنزيمات المستخدمة، ووقت رد الفعل. ولذلك فإن ردود الفعل على نطاق صغير مهمة لتحديد أفضل حالة قبل إعداد رد فعل واسع النطاق.
DRaCALA لديه بوضوح بعض المزايا والعيوب (انظر Roelofs وآخرون9 لمزيد من المناقشة) بالمقارنة مع تقنيات أخرى مثل تقنية مركب التقاط. أولا، يستخدم DRaCALA 32P المسمى (p)ppGpp، والذي لا يؤثر على التركيب الكيميائي ل (p)ppGpp، وبالتالي الحفاظ على تفاعله مع البروتينات المستهدفة المحتملة. ثانيا، بمجرد أن يتم إعداد 32p-(p)ppGpp وlysates الخلية، فإنه يأخذ سوى أسبوع لفحص ~ 60 لوحات من مكتبة E. coli ORFeome باستخدام DRaCALA. في الواقع ، سمح الإجراء التجريبي القصير (القسم 4) بتحديد حتى البروتينات التي تتحلل (p) ppGpp (MutT ، NudG)12،17، والتي غابت تقنية مركب الالتقاط18.
ومع ذلك ، فإن استخدام DRaCALA يتطلب مكتبة تعبير ORFeome ، والتي لا تتوفر إلا لعدد محدود من الكائنات الحية النموذجية. الى جانب ذلك ، فإن علامات تنقية التقارب ، والتي تم تصميمها لتسهيل تنقية البروتين في مكتبة ORFeome ، تؤثر في بعض الأحيان على التعبير أو الطي السليم للبروتينات ، مما ينتج بعض السلبيات الكاذبة. مكتبة ORFeome جديدة سوف تتطلب من الناحية المثالية تحديد ما إذا كان يتم التعبير عن غالبية (>80٪) من البروتينات في شكل قابل للذوبان وبكميات كافية. كما يسمح هذا الاختبار للباحثين بتقييم تغطية وفعالية نتائج فحص DRaCALA.
على الرغم من هذه القيود، DRaCALA هو تقنية قوية للكشف بنجاح البروتينات المستهدفة الرواية من العديد من الرسل الثانوية النيوكليوتيدات. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام DRaCALA لدراسة أي ليغاند صغير إذا كان يمكن تسميته باستخدام النظائر المشعة أو حتى الأصباغ الفلورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل منحة مشروع NNF (NNF19OC0058331) إلى YEZ، وبرنامج أفق الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار لعام 2020 بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا كوري (Nº 801199) إلى MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
