Summary
利甘德分析(DRaCALA)的微分径向毛细管作用可用于使用ORFeome库识别生物体的小配体结合蛋白。
Abstract
在过去的十年里,细菌生理学中对小信号分子的理解取得了巨大的进步。特别是,在模型生物体中系统地识别和研究了几个核苷酸衍生的二次信使(NSM)的目标蛋白质。这些成就主要归功于一些新技术的发展,包括捕获复合技术和配体检测(DRaCALA)的微分径向毛细管作用,这些技术被用来系统地识别这些小分子的目标蛋白质。本文描述了使用NSM,瓜诺辛五角星和四磷酸盐(p)pppGpp,作为DRACALA技术的例子和视频演示。使用DRaCALA,在模型有机体 Escherichia大肠杆菌 K-12中发现了20种已知蛋白质中的9种,以及12种新靶蛋白(p)pppGpp,显示了这种测定的力量。原则上,DRACALA可用于研究可标有放射性同位素或荧光染料的小配体。这里讨论了 DRACALA 的关键步骤、优点和缺点,以便进一步应用此技术。
Introduction
细菌使用几个小信号分子来适应不断变化的环境1,2。例如,自动诱导剂,N-乙酰异丙胺乳酮及其改良的寡肽,调解细胞间细菌之间的交流,以协调人群行为,这种现象被称为法定人数感应2。另一组小信号分子是NSM,包括广泛研究的环状腺苷单磷酸盐(cAMP)、环二聚氨酸、环状二磷酸盐(环二磷酸盐)和瓜诺辛五磷酸盐和四磷酸盐(p)pppGpp1。细菌产生这些NSM作为对各种不同压力条件的反应。一旦产生,这些分子结合到他们的目标蛋白质,并调节几个不同的生理和代谢途径,以应付遇到的压力,提高细菌的生存能力。因此,识别目标蛋白是破译这些小分子分子功能的必然前提。
在过去的十年里,对这些小信号分子的了解激增,这主要是因为一些技术创新揭示了这些小分子的目标蛋白质。其中包括捕获复合技术3,4,5,和配体检测(DRaCALA)6的微分径向毛细管作用,本文将讨论。
DRaCALA 由文森特·李和同事于 2011年 6 月发明,它部署了硝基纤维素膜的能力,以微分隔离无蛋白质和蛋白质结合的配体。蛋白质等分子不能扩散到亚硝基纤维素膜上,而小配体(如NSM)能够扩散。通过将NSM(例如ppGpp)与要测试的蛋白质混合,并在膜上发现它们,可以预期两种情况(图1):如果(p)ppppp与蛋白质结合,放射性标签(p)pppGpp将由蛋白质保留在点的中心,并且不会向外扩散,从而给出一个强烈的小点(即, 强烈的放射性信号)在磷构体下。然而,如果(p)pppGpp不与蛋白质结合,它将自由向外扩散,产生一个具有均匀背景放射性信号的大点。
此外,如果蛋白质存在足够的量,DRACALA可以检测小分子和整个细胞解剖中未纯化蛋白质之间的相互作用。这种简单性允许使用 DRACALA 使用 ORFeome 表达库快速识别蛋白质靶点。事实上,使用 DRaCALA 系统地识别了 cAMP7、环形二安培8、环形二聚氰化物9、10和 (p) pppGpp 11、12、13 的目标蛋白质。本视频文章以 (p) ppGpp 为例,演示和描述成功进行 DRACALA 筛查的关键步骤和考虑因素。值得注意的是,强烈建议在执行 DRACALA 之前,结合本文阅读对 DRACALA14进行更详尽的描述。
图1:德拉卡拉(A)示意图分析原理。有关详细信息,请参阅文本。(B) 约束分数的量化和计算。有关详细信息,请参阅文本。简言之,DRaCALA 点将通过绘制两个圆圈来分析,这些圆圈将整个点和内部暗点(即由于测试蛋白质的结合而保留的 (p)pPpGpp)。特定的结合信号是减去非特定背景信号(按A1×计算(S 2-S 1)/(A2-A1)后内圈(S1)的放射性信号。结合分数是除以总放射性信号 (S2) 的特定绑定信号。缩写: Dracala = 利甘德分析的差速径向毛细管操作;(p) ppgpp = 瓜诺辛五角星和四磷酸盐;RT = 室温。请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
1. 准备整个细胞解解剂
- 接种 大肠杆菌 K-12 ASKA ORFeome系列菌株15 到1.5mL莱索根肉汤(LB),含有25微克/mL氯霉素在96井深井板。在 30 °C 下生长 18 小时(O/N),在 160 rpm 时摇晃。第二天,在O/N培养物中加入异丙基β-d-1-硫高拉托平旁(IPTG)(最终0.5mM),以在30°C为6h时诱导蛋白质表达。
- 颗粒细胞在 500 x g 为 10 分钟。将颗粒冻结在 -80 °C 下,直到使用。要解冻细胞,请添加 150 μL 裂解缓冲 L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 m M NaCl, 10 m MgCl2, 辅以 2m 苯甲基磺胺 (PMSF), 40 μg/mL DNase 1, 和 0.5 毫克/mL 溶酶) 以重新悬浮颗粒。
- 将细胞冻结在 -80 °C 下 30 分钟,然后在 37 °C 下解冻 20 分钟。重复此循环三次以解合细胞。使用前将解剖物存储在 -80 °C。
2. 净化雷尔塞克 和格帕
注:来自链球菌等价物的重组蛋白Relseq和来自大肠杆菌K-12的GppA分别用于合成放射性标签pppGpp和ppGpp。
- 生长和收集细胞过度表达每种蛋白质。
- 将大肠杆菌BL21 DE3 菌株种植到 LB 汤中的指数相(光学密度 (OD) +0.3-0.4),并在 6000 x g下旋转 1 mL 培养体,持续 5 分钟。将超高肉汤除以,并重新使用 100 μL 冰冷 TSB 汤(LB 汤辅以 0.1 克/mL PEG3350、0.05 mL/mL 二甲基硫化物、20 m M MgCl2)。
- 将带有组织丁标签的乳腺和gppA混合,每粒 100 ng,在 TSB 中加入上述细胞悬浮物,并在冰上孵育 30 分钟。热冲击细胞在42°C为40s。将混合物放在冰上2分钟,并在室温下加入1mL的LB肉汤,使细胞在37°C时恢复1小时,在160转时搅拌。
- 将回收的细胞镀在 LB Agar 板上,辅以相应的抗生素(Relseq:100 μg/mL 安皮西林;GppA: 30 微克/mL 卡纳霉素)。第二天,在LB肉汤中给菌落接种疫苗,在37°C下开始两种菌株的O/N预栽培。
- 18小时后,接种500 mL的LB介质,10 mL的O/N培养物和相应的抗生素。在 37 °C 下以 160 rpm 的速度摇晃来培养文化。 当OD600nm 达到 0.5-0.7 时,通过添加 0.5 mM IPTG 来诱导蛋白质表达,并在 30 °C 下生长 3 小时,在 160 rpm 时摇晃。
- 在 4 °C 下以 6084 x g 旋转 10 分钟来收集细胞。 将颗粒重新沉积在 20 mL 的冰冷 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中,并在 1912 x g 下以 1912 x g 在 4 °C 下重新离心机 20 分钟。 将超高颗粒除以-20°C,然后再使用。
- 镍-氮酸(尼-NTA)亲和纯化
注意:从此以后,请确保样品是冷的。- 加入40mL的冰冷裂解缓冲L2(50mM Tris pH 7.5,150mM NaCl,5%甘油,10mM imidazole,10mM β-甲醇补充蛋白酶抑制剂(EDTA无片剂:见 材料表)来重新使用颗粒。通过声波(60% 振幅,2 s On/4 s 关闭 8 分钟开)来解振细胞。在 4°C 下以 23,426 x g 旋转 40 分钟,清除解糖,并继续用超高分子进行净化。
- 在上述离心过程中,准备尼-NTA树脂。
- 将 500 μL 的同质化 Ni-NTA 树脂转移到站立的聚丙烯色谱柱中,让它沉淀 15 分钟,存储溶液排出。用 15 mL 超纯水清洗树脂两次,然后用 15 mL 的裂解缓冲器 L2 清洗柱子。
- 将清除的细胞解解剂从第 1 步加载到柱子上,然后让它流过。用 30 mL 的洗涤缓冲器(50 m Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% 甘油、20 mM imidazole)清洗柱子。
- 用 400 μL 的洗发缓冲器 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% 甘油, 500 mM imidazole) 三次来吸收蛋白质。然后,用另外 300 μL的放射缓冲器重复。将精化蛋白组合到最终体积为 700 μL。
- 凝胶过滤
- 准备凝胶过滤缓冲器(50 mM Tris,pH 7.5;200mM NaCl;5%甘油)。用凝胶过滤缓冲器的一列体积(25 mL)清洗尺寸排除列。
- 使用 500 μL 循环加载上述 700 μL 样品,以 0.5 mL/min 的速度运行,并收集包含相应蛋白质的 0.5 mL 体积的 2-3 个分数。
- 使用自旋柱组合和浓缩包含每个蛋白质的分数,并使用布拉德福德检测测量蛋白质浓度。
3. 合成 32个 P 标记的 pppgpp 和 ppgpp
- 在螺丝帽管中组装小规模的 Relseq反应(参见表 1)。
注:仅在有执照的地方使用放射性试剂和个人防护设备。
卷 (μL) | ||
小规模 | 大型 | |
超纯水 | ||
10 倍雷尔塞克 缓冲* | 2 | 50 |
ATP (8 mM 决赛) | ||
雷尔塞克 (4 μM 决赛) | ||
32P-α-瓜诺辛三磷酸盐(GTP)(最终120纳米)(警告) | 0.2 | 5 |
总 | 20 | 500 |
表1:汇总32个P标签ppgpp的小型和大规模合成反应信息。 *10倍Relseq缓冲器包含250mTris-HCl,pH 8.6:1M 纳克;80m M MgCl2。缩写: pppgpp = 瓜诺辛五磷酸盐。
- 在 37 °C 的热混合器中孵育管子 1 小时,然后在 95 °C 处孵化 5 分钟,并在冰上放置 5 分钟。将沉淀蛋白以 15,700 x g 旋转 5 分钟,并将超高纳特(合成 32P-pppGpp)转移到新的螺丝帽管中。
- 要从 32Ppppp 中合成 32PppGpp,将 32pppGpp 产品的一半转移到新的螺丝帽管中,并添加 1 μM Gppa。在 37 °C 处孵育管子 10 分钟,在 95 °C 处孵化 5 分钟,然后在冰上放置 5 分钟。
- 将沉淀蛋白以 15,700 x g 旋转 5 分钟,并将超高纳特(合成 32P-ppGpp)转移到新的螺丝帽管中。
- 使用1.5 M KH 2PO4、pH 3.4作为移动相,在薄层色谱 (TLC) 板 (聚乙烯改性纤维素 TLC 板) 上运行 1 μL 的样品,分析 32 个 P-pppgpp 和32个 P-ppGpp。
注:使用α-32P标签瓜诺辛5'-三磷酸盐(32P-α-GTP)作为控制。 - 将 TLC 板完全干燥,放在透明塑料文件夹之间,并将其暴露在存储磷屏上 5 分钟。使用磷化剂可视化和量化信号。
注:当 32个P-pppGpp和 32个P-ppGpp的比例高于85%时,可以通过使用 表1进行大规模反应(500微升,足以筛选20个96井板)。
4. Dracala 筛选目标蛋白质 (p) p. pgpp
- 解冻并转移 20 微升整个细胞解冻剂到 96 井 V 底微提亚板。从 塞拉蒂亚马塞森加入2.5U/井内分泌酶,在37°C下孵育15分钟,以降低莱萨特粘度。将解冻剂放在冰上20分钟。
- 将 32PppGpp 和 32PppGpp 混合在 1:1 的比例中,并添加 1 倍裂解缓冲 L1,使 (p)pppGpp 的最终浓度等于 4 nM。
注:鉴于 pppGpp 和 ppGpp 的化学相似性,这两种化学品的混合将简化筛选过程。 - 使用多通道移液器和过滤移液器提示添加和混合 10 μL 的 (p)ppGpp 混合物与细胞解分析器。在室温下孵育 5 分钟。
- 将 0.01% 的非离子洗涤剂溶液放入 30s 中,并在纸巾上干燥 30s,从而清洗 96 x 针工具。重复洗净引脚工具 3 倍。
- 将引脚工具放在上面的 96 井样品板中,等待 30s。将销工具直接向上抬起,并将其直接放置在硝基纤维素膜上 30 秒。
注意:如果缺少一个点,请用移液器和过滤提示发现相应的样品的 2 μL。建议对下文所示的相同样本进行重复点。 - 在 RT 处将膜干燥 5 分钟,将膜放在透明塑料文件夹之间,并将其暴露在存储磷屏上 5 分钟。使用磷化法可视化。
5. 潜在目标蛋白的量化和鉴定
- 使用与磷化器相关的分析软件打开可视化板的 .gel 文件。使用 阵列分析 功能,通过设置由 12 列 x 8 行组成的网格来定义 96 个点。
- 定义大圆圈以限制整个点的外缘(见 图1B)。导出定义的大圆圈的 Volumn®背景 和 区域 ,并保存在电子表格中。
注:如果需要,重新定位每个圆,使其与点完全重叠,并调整每个圆圈的大小,使其略大于实际点。 - 向下大小定义的圆,以限制小内点。导出 Volumn+背景和定义的小圆圈 区域 ,并保存在电子表格中。
- 使用 图 1B中的方程计算电子表格中的绑定分数,并绘制数据图。与其他大多数油井相比,确定油井中具有高结合分数的潜在结合蛋白。
图2:DRACALA筛选过程的总体工作流程。 从 大肠杆菌 ASKA集合产生的蛋白质被诱导,细胞被解解。同时,重组蛋白Relseq-他和GppA-His被净化,用于合成 32个P标签的ppgpp和ppGpp从 32个P-α-GTP。放射性标记 (p) ppGpp 分子随后与解糖混合,并使用 96 针工具在硝基纤维素膜上发现混合物,以便随后暴露在磷存储屏、成像和放射性信号定量中。缩写: Dracala = 利甘德分析的差速径向毛细管操作;(p) ppgpp = 瓜诺辛五角星和四磷酸盐;RT = 室温;Iptg = 异丙基β - d - 1 - 硫高卢托皮拉诺赛德;GTP = 瓜诺辛 5'-三磷酸盐;SDS-PAGE = 钠二甲基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳;TLC = 薄层色谱。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
遵循上述协议通常会产生两种类型的结果(图3)。
图 3A显示大多数油井的背景绑定信号相对较低的板(绑定分数< 0.025)。来自油井 H3 的正绑定信号给出的绑定分数为 ±0.35,远远高于其他油井的绑定分数。即使没有量化,H3 也非常显著,表明 H3 中表达的目标蛋白质与 pppGpp、ppGpp 或两者兼有。事实上,在H3井中过度表达的蛋白质是低氧磷酸乙基转移酶Hpt,它已知结合(p)ppGpp12,16。
图3:代表德拉卡拉筛选板(左)和量化(右图)。 (A) ASKA板-50的德拉卡拉点。唯一的正面命中,Hpt,给出了一个强大的约束信号,突出在现场和量化图。(B,C)重新排列的板 31 的两个复制德拉卡拉点。黑色破碎的圆圈和箭头表示(p)pppGpp的真正目标蛋白,而红色破碎的圆表示误报。有关详细信息,请参阅文本。缩写: Dracala = 利甘德分析的差速径向毛细管操作;(p) ppgpp = 瓜诺辛五角星和四磷酸盐;RT = 室温;Iptg = 异丙基β - d - 1 - 硫高卢托皮拉诺赛德;GTP = 瓜诺辛 5'-三磷酸盐;SDS-PAGE = 钠二甲基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳;TLC = 薄层色谱;Hpt = 低氧磷酸乙基转移酶;PrfC = 肽链释放因子 RF3;纳德 = NMN 腺基转移酶;Hflx = 翻译 Gtpase 。 请单击此处查看此图的较大版本。
筛选的另一个典型结果显示在图3B,C。在这个板块中,几口井的背景绑定信号比图3A中显示的要高。从许多油井相对强大的内点可以清楚地看到这一点。量化还表明,许多油井的结合分数在0.02-0.04之间。结合信号的更高背景可能是由于整个细胞解剖是粘性的,尽管治疗与DNase I和内分泌酶从S.马塞森,这降解释放的染色体DNA。对于这样的板块,比较板块的两个复制点(第 4.5 步:第 4.5 步)非常重要。图3B,C)。两个板的量化表明,真正的正目标(黑圈,井A10PrfC,B11 NadR)往往给一贯的高结合分数。
值得注意的是,一些真正的目标也可以给出可变的绑定分数(嗯D5,HflX12),如误报(红色圆圈)。这种变异的原因是,并不是库中所有的蛋白质都以可溶性的形式和所需的量表达。如果蛋白质的浓度接近或略低于 Kd 值,则可以预期可变结合结果,即使是真正的目标也是如此。事实上,大量的可溶性HflX蛋白并没有从ASKA菌株12中获取。要确定这些蛋白质是否是真正的活页夹,必须利用蛋白质的浓度更高(50-100 μM)来纯化到同质性和结合确认。
通过这次筛选,确定了(p)pppGpp12 的20种已知目标蛋白中的9种(参见讨论部分),验证了DRACALA对这项任务的用处。此外,还发现了并确认了12个新的目标(p)pppGpp,表明DRACALA是发现(p)ppppp新靶蛋白的有力技术。
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Discussion
进行 DRACALA 筛查的关键步骤之一是获得良好的全细胞解解。首先,测试的蛋白质应大量和可溶性地生产。其次,细胞的裂解应完成,裂解剂的粘度必须极小。酶的加入和三个冷冻-解冻周期的使用往往足以完全解冻细胞。然而,释放的染色体DNA使溶质粘稠,并产生高背景结合信号,导致误报如图3B,C所示。为了减轻这种情况,可以使用来自S.马塞森的Dnase 1和/或内分泌酶,并且样品可以孵育更长的时间来降解DNA。
在进行大规模筛查之前,应使用阴性(空质粒载体)和正(已知目标蛋白)控制来优化整个细胞解质制备和DRaCALA结合检测的条件。当发现这种最佳条件时,就没有必要在实际筛选每个板中包括控制。这是因为筛选过程非常短,而且盘子中的大多数蛋白质不会与 (p)pppp 结合。因此,这些蛋白质在量化结合分数时起到负控制作用(图3)。
生产更纯净的 32P 标签 pppgpp 和 ppgpp 对于 Dracala 筛查也至关重要。例如,GTP 与 pppGpp 的转换比率可能有所不同。因此,优化pH值、镁和酶的浓度以及反应时间非常重要。因此,小规模反应对于在建立大规模反应之前确定最佳状态非常重要。
与其他技术(如捕获复合技术)相比,DRaCALA 显然有一些优点和缺点(请参阅 Roelofs等人进行更多讨论)。首先,DRaCALA 使用32个 P 标记 (p)ppGpp,它不会影响 (p) ppppp 的化学结构,从而保持其与潜在目标蛋白的相互作用。其次,一旦准备了32p-pppGpp和细胞解解剂,使用DRaCALA筛选60个大肠杆菌库的盘子只需要一周时间。事实上,简短的实验程序(第4节)甚至允许识别降解(p)pppGpp(MutT,NudG)12,17的蛋白质,捕获复合技术错过了18。
但是,使用 DRACALA 需要一个 ORFeome 表达库,该库仅适用于数量有限的模型生物体。此外,亲和力纯化标签,旨在促进蛋白质纯化在ORFeome库,有时影响蛋白质的表达或适当的折叠,产生一些假底片。理想的情况是,新的ORFeome库需要确定大多数(>80%)蛋白质是否以可溶性形式和足够数量表达。这种测试还使研究人员能够评估DRACALA筛查结果的覆盖范围和有效性。
尽管有这些限制,DRACALA 是成功发现几个核苷酸二次信使的新靶蛋白的强大技术。原则上,DRACALA可用于研究任何小配体,如果它可以通过使用放射性同位素,甚至荧光染料标记。
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Disclosures
作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
这项工作得到向YAZ提供的NNF项目赠款(NNF19OC0058331)以及根据玛丽·斯考多夫斯卡-居里赠款协议(No 801199)向MLS提供的欧洲联盟地平线2020研究和创新方案的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
MilliQ water | ultrapure water | ||
multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
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