Summary
Den differentierede Radial Kapillæraktion fra Ligand Assay (DRaCALA) kan bruges til at identificere små ligand bindende proteiner i en organisme ved hjælp af et ORFeome-bibliotek.
Abstract
Det seneste årti har oplevet enorme fremskridt i forståelsen af små signalmolekyler i bakteriel fysiologi. Især er målproteinerne fra flere nukleotid-afledte sekundære budbringere (NSMs) systematisk blevet identificeret og undersøgt i modelorganismer. Disse resultater skyldes hovedsagelig udviklingen af flere nye teknikker, herunder indfangningsblandingsteknikken og den differentierede radiale kapillærvirkning af ligand assay (DRaCALA), som blev brugt til systematisk at identificere målproteiner af disse små molekyler. Dette papir beskriver brugen af NSMs, guanosine penta- og tetraphosphater (p)ppGpp, som et eksempel og video demonstration af DRaCALA teknik. Ved hjælp af DRaCALA blev 9 ud af 20 kendte og 12 nye målproteiner af (p)ppGpp identificeret i modelorganismen, Escherichia coli K-12, hvilket viser kraften i denne analyse. I princippet kan DRaCALA bruges til at studere små ligands, der kan mærkes af radioaktive isotoper eller fluorescerende farvestoffer. De kritiske trin, fordele og ulemper ved DRaCALA diskuteres her for yderligere anvendelse af denne teknik.
Introduction
Bakterier bruger flere små signalmolekyler til at tilpasse sig konstant skiftende miljøer1,2. For eksempel, autoinducers, N-acylhomoserine lactones og deres modificerede oligopeptider, mægle intercellulær kommunikation mellem bakterier til at koordinere befolkningens adfærd, et fænomen kendt som quorum sensing2. En anden gruppe af små signalmolekyler er NSM'erne, herunder det almindeligt undersøgte cykliske adenosinmonophosphat (cAMP), cyklisk di-AMP, cyklisk di-guanosinmonophosphat (cyklisk di-GMP) og guanosinpenta- og tetraphosphater (p)ppGpp1. Bakterier producerer disse NSMs som en reaktion på en række forskellige stress betingelser. Når de er produceret, binder disse molekyler sig til deres målproteiner og regulerer flere forskellige fysiologiske og metaboliske veje for at klare de stødte belastninger og forbedre bakterieoverlevelser. Derfor er identifikation af målproteinerne en uundgåelig forudsætning for at dechifrere de molekylære funktioner i disse små molekyler.
Det seneste årti har været vidne til et boom af viden om disse små signalmolekyler, hovedsageligt på grund af flere tekniske innovationer, der afslørede målproteinerne i disse små molekyler. Disse omfatter fangst sammensatte teknik3,4,5, og differentiale radial kapillær virkning af ligand assay (DRaCALA)6, der skal drøftes i dette papir.
Opfundet af Vincent Lee og kolleger i 20116, DRaCALA anvender muligheden for en nitrocellulose membran til differentieret sequester fri og protein-bundet ligands. Molekyler som proteiner kan ikke diffuse på en nitrocellulosemembran, mens små ligands, såsom NSMs, er i stand til. Ved at blande NSM (f.eks.ppGpp) med det protein, der skal testes, og spotte dem på membranen, kan der forventes to scenarier (figur 1): Hvis (p)ppGpp binder sig til proteinet, vil den radiolabelerede (p)ppGpp blive bevaret i midten af stedet af proteinet og vil ikke sprede udad, hvilket giver en intens lille prik (dvs. stærkt radioaktivt signal) under en fosformager. Men hvis (p)ppGpp ikke binder sig til proteinet, vil det spredes frit udad for at producere et stort sted med ensartet baggrundsradioaktivt signal.
Desuden kan DRaCALA detektere samspillet mellem et lille molekyle og et upurificeret protein i en hel celle lysat, hvis proteinet er til stede i en tilstrækkelig mængde. Denne enkelhed gør det muligt at bruge DRaCALA til hurtigt at identificere proteinmål ved hjælp af et ORFeome-udtryksbibliotek. Målproteiner af cAMP7, cyklisk di-AMP8, cyklisk di-GMP9,10og (p)ppGpp11,12,13 er systematisk blevet identificeret ved hjælp af DRaCALA. Denne videoartikel bruger (p)ppGpp som et eksempel til at demonstrere og beskrive de kritiske trin og overvejelser i forbindelse med udførelsen af en vellykket DRaCALA-screening. Bemærk, at en mere grundig beskrivelse af DRaCALA14 anbefales stærkt at læse i kombination med denne artikel, før du udfører DRaCALA.
Figur 1: Princippet om DRaCALA. (A) Skematisk over DRaCALA-analysen. Se teksten for at få flere oplysninger. (B) Kvantificering og beregning af bindingsfraktionen. Se teksten for at få flere oplysninger. Kort sagt vil DRaCALA pletter blive analyseret ved at tegne to cirkler, der afgrænser hele stedet og den indre mørke prik(dvs.den bevarede (p) ppGpp på grund af bindingen af det testede protein). Det specifikke bindingssignal er indercirklens (S1) radioaktive signal efter fratrækning af det ikke-specifikke baggrundssignal (beregnet ved A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindingsfraktionen er det specifikke bindingssignal divideret med det samlede radioaktive signal (S2). Forkortelser: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; p)ppGpp = guanosinpenta- og tetraphosphater RT = stuetemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af lysater af hele celler
- E. coli K-12 ASKA ORFeome-opsamlingsstammernepodes 15 til 1,5 mL Lysogeny bouillon (LB), der indeholder 25 μg/mL chloramphenicol i 96-godt dybe brøndplader. Der tilstøses natten over (O/N) i 18 timer ved 30 °C med omrystning ved 160 omdrejninger i minuttet. Den næste dag tilsættes isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (endelig 0,5 mM) til O/N-kulturerne for at fremkalde proteinudtryk ved 30 °C i 6 timer.
- Pellet celler på 500 x g i 10 min. Pellets fryses ved -80 °C, indtil de bruges. For at lyse cellerne tilsættes 150 μL lysis buffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, suppleret med 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 og 0,5 mg/mL lysozym) til genbrug af pellet.
- Cellerne fryses ved -80 °C i 30 min. og tø derefter ved 37 °C i 20 min. Gentag denne cyklus tre gange for at lyse cellerne. Lysater opbevares ved -80 °C før brug.
2. Rensning af Relseq og GppA
BEMÆRK: Rekombinantproteinerne Relseq fra henholdsvis Streptococcus equisimilis og GppA fra E. coli K-12 bruges til at syntetisere henholdsvis den radiolabelerede pppGpp og ppGpp.
- Vokse og indsamle celler overekspresserende hvert protein.
- Øg E. coli BL21 DE3-stammen op til eksponentiel fase (optisk tæthed (OD) ~0,3-0,4) i LB-bouillon, og spin ned 1 mL kultur ved 6000 x g i 5 min. Supernatanten dekanteres og genbruges cellerne med 100 μL iskold TSB bouillon (LB bouillon suppleret med 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/mL dimethylsulfoxid, 20 mM MgCl2).
- Bland plasmider forsynet med histidin-mærkede relseq og gppA, hver 100 ng, med ovenstående celle suspensioner i TSB, og inkubere på is i 30 min. Cellerne opvarmes ved 42 °C i 40 s. Blandingen anbringes på is i 2 min. og tilsættes 1 mL LB-bouillon ved stuetemperatur, så cellerne kan komme sig i 1 time ved 37 °C med omrøring ved 160 omdrejninger i minuttet.
- Plade de genvundne celler på LB agar plader suppleret med de tilsvarende antibiotika (Relseq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). Den næste dag vaccineres kolonierne i LB-bouillon for at starte O/N-prækulturer af begge stammer ved 37 °C.
- Efter 18 timer podes 500 mL LB-medium med 10 mL af O/N-kulturerne og de tilsvarende antibiotika. Dyrke kulturerne ved at ryste ved 160 omdrejninger ved 37 °C. Når OD600nm når 0,5-0,7, fremkalde protein udtryk ved at tilføje 0,5 mM IPTG og vokser i 3 timer ved 30 °C med rysten ved 160 omdrejninger i minuttet.
- Cellerne opsamles ved spinding ved 6084 x g i 10 minutter ved 4 °C. Pelletpen blev genbrugt i 20 mL iskold 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) og centrifugeret ved 1912 x g i 20 min ved 4 °C. Supernatanten dekanteres, og pellets fryses ved -20 °C før brug.
- Nikkelnitritridikesyre (Ni-NTA) affinitetsrensning
BEMÆRK: Sørg for, at prøverne er kolde fra dette tidspunkt.- Der tilsættes 40 mL iskold lysis buffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazol, 10 mM β mercaptoethanol suppleret med proteasehæmmere (EDTA-fri tablet; se materialetabellen)for at genbruge pelleten. Lys cellerne via sonikering (60% amplitude, 2 s ON / 4 s OFF i 8 min ON). Lysatet renses ved at dreje ved 23.426 x g i 40 minutter ved 4 °C, og fortsæt med supernatanten til rensning.
- Under ovennævnte centrifugering forberedes Ni-NTA-harpiksen.
- 500 μL homogeniseret Ni-NTA harpiks overføres til en stående polypropylenkromatografikolonne, og lad den afregne i 15 minutter, og opbevaringsopløsningen løber igennem. Harpiksen vaskes med 15 mL ultrapure vand to gange, og derefter vaskes kolonnen med 15 mL lysis buffer L2.
- Læg den ryddede supernatant af cellelysat fra trin 1 på kolonnen, og lad den flyde igennem. Kolonnen vaskes med 30 mL vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol).
- Elute proteinerne med 400 μL elueringsbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) tre gange. Gentag derefter eluering med yderligere 300 μL af elutionsbufferen. De eluterede proteiner kombineres til et slutvolumen på 700 μL.
- Gelfiltrering
- Forbered gelfiltreringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glycerol). Størrelsen udvaskes kolonne med en kolonne volumen (25 mL) af gel filtrering buffer.
- Ovennævnte 700 μL prøve indlæses ved hjælp af en 500 μL-løkke, der køres ved 0,5 mL/min, og der opsamles 2-3 fraktioner, hver af 0,5 mL volumen, der indeholder de respektive proteiner.
- Kombiner og koncentrer de fraktioner, der indeholder hvert af proteinerne, ved hjælp af en spinkolonne, og mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-analysen.
3. Syntese af 32P-mærkede pppGpp og ppGpp
- Sammensæt en lille Relseq reaktion i et skruehætterør (se tabel 1).
BEMÆRK: Arbejde med radioaktive reagenser kun på et licenseret sted og med personlige værnemidler.
| Volumen (μL) | ||
| Lille skala | Store | |
| Ultrapure vand | ||
| 10x Relseq buffer* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM finale) | ||
| Relseq (4 μM endelig udg.) | ||
| 32 år P-α-Guanosine triphosphat (GTP) (endelig 120 nM) (ADVARSEL) | 0.2 | 5 |
| total | 20 | 500 |
Tabel 1: Samling af oplysninger om de små og store syntesereaktioner på 32P-mærkede pppGpp. *10x Relseq buffer indeholder 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Forkortelse: pppGpp = guanosine pentaphosphat.
- Røret inkuberes ved 37 °C i en termomixer i 1 time, derefter ved 95 °C i 5 min. og anbringes på is i 5 min. Spin ned udfældet protein på 15.700 x g i 5 min, og overføre supernatant (syntetiseret 32P-pppGpp) til en ny skrue hætte rør.
- For at syntetisere 32P-ppGpp fra 32P-pppGpp overføres halvdelen af 32p-pppGpp-produktet til et nyt skruehætterør, og der tilsættes 1 μM GppA. Røret inkuberes ved 37 °C i 10 min. ved 95 °C i 5 min. og anbringes derefter på is i 5 min.
- Spin ned udfældet protein på 15.700 x g i 5 min, og overføre supernatant (syntetiseret 32P-ppGpp) til en ny skrue hætte rør.
- Analyser 32P-pppGpp og 32P-ppGpp ved at køre 1 μL af prøverne på en TLC-plade (thin layer chromatography) (polyethylenmodificerede cellulose-TLC-plader) ved hjælp af 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, som mobil fase.
BEMÆRK: Brug α-32P-mærket guanosin 5'-triphosphat (32P-α-GTP) som kontrol. - Tør TLC-pladen helt, placer den mellem en gennemsigtig plastmappe, og udsæt den på en opbevaringsphosphorskærm i 5 minutter. Visualiser og kvantificere signalerne ved hjælp af en fosformager.
BEMÆRK: Når forholdet mellem 32P-pppGpp og 32P-ppGpp er højere end 85%, kan en storstilet reaktion (500 μL, der er tilstrækkelig til screening af 20 96-brøndsplader) samles og syntetiseres ved hjælp af tabel 1.
4. DRaCALA-screening af målproteiner i (p)ppGpp
- Optø og overføre 20 μL af hele cellen lysater til en 96-brønd V-bund mikrotiter plade. Der tilsættes 2,5 U/brønd endonuklease fra Serratia marcescensog inkuberes ved 37 °C i 15 minutter for at reducere lysatviskositeten. Placer lysater på is i 20 min.
- Bland 32P-pppGpp og 32P-ppGpp i et 1:1-forhold, og tilsæt 1x lysis buffer L1 for at gøre den endelige koncentration af (p)ppGpp lig med 4 nM.
BEMÆRK: I betragtning af den kemiske lighed mellem pppGpp og ppGpp vil en blanding af begge kemikalier forenkle screeningsprocessen. - Brug en flerkanalpipette og filtrerede pipettespidser til at tilføje og blande 10 μL af (p)ppGpp blandingen med cellelysatet. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Vask 96 x pin værktøj ved at placere i 0,01% opløsning af non-ioniske vaskemiddel i 30 s, og tør på et silkepapir i 30 s. Gentag vask af pinværktøjet 3x.
- Sæt pinværktøjet i ovenstående 96-brønds prøveplader, og vent i 30 s. Løft pinværktøjet lige op, og læg det lige ned på en nitrocellulosemembran i 30 s.
BEMÆRK: Hvis der mangler en plet, skal du punkt 2 μL af de tilsvarende prøver med en pipette og filtrerede spidser. Det tilrådes at foretage en dobbelt plet af den samme prøve som angivet nedenfor. - Tør membranen i 5 min på RT. Placer membranen mellem en gennemsigtig plast mappe, og udsætte det for en opbevaring fosfor skærm i 5 min. Visualiser ved hjælp af en fosformager.
5. Kvantificering og identifikation af potentielle målproteiner
- Brug den analysesoftware, der er tilknyttet fosformageren, til at åbne .gel-filen på de visualiserede plader. Brug funktionen Matrixanalyse til at definere de 96 pletter ved at oprette et gitter med 12 kolonner x 8 rækker.
- Definer store cirkler for at afgrænse yderkanten af hele pletterne (se figur 1B). Eksporter Volumn+Baggrund og Område i de definerede store cirkler, og gem i et regneark.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du flytte hver enkelt cirkel, så den overlapper pletterne perfekt, og ændre størrelsen på hver enkelt cirkel for at gøre den lidt større end det faktiske sted. - Tilpas størrelsen på de definerede cirkler for at afgrænse de små inderste prikker. Eksporter Volumn+Backgroundog Area i de definerede små cirkler, og gem i et regneark.
- Beregn bindingsbrøkene i regnearket ved hjælp af ligningen i Figur 1B, og afbilde dataene. Identificer de potentielle bindende proteiner i brøndene, der viser høje bindende fraktioner i forhold til de fleste andre brønde.
Figur 2: Samlet arbejdsgang for DRaCALA-screeningsprocessen. Proteinproduktion fra en Escherichia coli ASKA kollektion induceres, og cellerne lyses. I mellemtiden er de rekombinante proteiner Relseq-Hansog GppA-His renset og bruges til at syntetisere 32P-mærket pppGpp og ppGpp fra 32P-α-GTP. De radioaktivt mærkede (p)ppGpp molekyler blandes derefter med lysater, og et 96 pin-værktøj bruges til at få øje på blandingerne på en nitrocellulosemembran til efterfølgende eksponering for en fosforlagringsskærm, billeddannelse og kvantificering af de radioaktive signaler. Forkortelser: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; p)ppGpp = guanosinpenta- og tetraphosphater RT = stuetemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-triphosphat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophoresis; TLC = tyndt lag kromatografi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ovennævnte protokol vil typisk give to typer resultater (Figur 3).
Figur 3A viser en plade med relativt lave baggrundsbindingssignaler (bindefraktioner < 0,025) fra de fleste brønde. Det positive bindingssignal fra brønden H3 giver en bindende brøkdel af ~ 0,35, der er meget højere end den, der observeres for de andre brønde. Selv uden kvantificering, godt H3 er bemærkelsesværdigt, tyder på, at et mål protein udtrykt i godt H3 binder sig til enten pppGpp, ppGpp, eller begge dele. Faktisk proteinet overekspresseret i godt H3 er hypoxanthin phosphoribosyltransferase Hpt, som er kendt for at binde (p) ppGpp12,16.
Figur 3: Repræsentative DRaCALA-screeningsplader (til venstre) og kvantificering (til højre). Det eneste positive hit, Hpt, gav et stærkt bindesignal, der stod ud i både stedet og kvantantitationsdiagrammet. (B,C) To replikerede DRaCALA pletter på den omarrangerede plade 31. Sorte brudte cirkler og pile angiver de sande målproteiner i (p)ppGpp, mens de røde brudte cirkler angiver de falske positiver. Se teksten for at få flere oplysninger. Forkortelser: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; p)ppGpp = guanosinpenta- og tetraphosphater RT = stuetemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-triphosphat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophoresis; TLC = tyndlagskromatografi; Hpt = hypoxanthin phosphoribosyltransferase; PrfC = peptidkædefrigivelsesfaktor RF3; NadR = NMN adenylyltransferase; HflX = translationel GTPase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det andet typiske resultat af screeningen er vist i figur 3B,C. I denne plade viste flere brønde relativt højere baggrundsbindingssignaler end dem i figur 3A. Dette er tydeligt synligt fra de relativt stærke indre prikker for mange brønde. Kvantificering viste også, at mange brønde har bindende fraktioner i intervallet 0,02-0,04. En højere baggrund af bindingssignalet skyldes sandsynligvis, at hele cellelysatet er tyktflydende på trods af behandlingerne med både DNase I og endonuklease fra S. marcescens, som nedbryder det frigivne kromosomale DNA. For plader som denne er det vigtigt at sammenligne de to replikatpletter på pladen (trin 4.5; Figur 3B, C). Kvantificering af begge plader viser, at de autentiske positive mål (sorte cirkler, brønde A10 PrfC, B11 NadR) har tendens til at give konsekvent høje bindende fraktioner.
Især kan nogle sande mål også give variable bindende fraktioner (Nå D5, HflX12) såsom falske positiver (røde cirkler). Årsagen til denne variation ligger i, at ikke alle proteiner i et bibliotek er udtrykt i opløselig form og i krævede mængder. Hvis koncentrationen af et protein er tæt på eller lige under K d-værdien, kan der forventes variable bindingsresultater, selv for de sande mål. Der blev faktisk ikke opnået store mængder opløseligt HflX-protein fra ASKA-stammen12. For at afgøre, om disse proteiner er bindemidler eller ej, skal de potentielle proteiner renses til homogenitet, og bindingen bekræftes ved hjælp af en højere koncentration (50-100 μM) af proteinerne.
Via denne screening blev 9 ud af 20 kendte målproteiner på (p)ppGpp12 identificeret (se diskussionsafsnittet), som validerede DRaCALA's nytte for denne opgave. Derudover blev 12 nye mål for (p)ppGpp opdaget og bekræftet, hvilket viser, at DRaCALA er en kraftfuld teknik til at afdække nye målproteiner af (p)ppGpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af de kritiske skridt i udførelsen af DRaCALA screening er at opnå gode hele celle lysater. For det første skal de testede proteiner produceres i store mængder og i opløselige former. For det andet skal cellernes lysis være komplet, og lysatets viskositet skal være minimal. Inddragelsen af lysozym og brugen af tre cyklusser af fryse-optøning er ofte nok til at lyse celler helt. Det frigivne kromosomale DNA gør imidlertid lysatet tyktflydende og genererer et højt baggrundsbindingssignal, hvilket resulterer i falske positiver som vist i figur 3B, C. For at afbøde dette kan DNase 1 og/eller endonuclease fra S. marcescens bruges, og prøverne kan inkuberes i længere tid for at nedbryde DNA'et.
Både negative (tomme plasmidvektor) og positive (kendte målprotein) kontroller bør anvendes til at optimere betingelserne for helcellet lysatpræparat og DRaCALA-bindingsanalysen, før der udføres en storstilet screening. Når en sådan optimal tilstand er fundet, bliver det unødvendigt at medtage kontrollerne i den faktiske screening af hver plade. Dette skyldes, at screeningsproceduren er meget kort, og fordi størstedelen af proteinerne i en plade forventes ikke at binde sig til (p)ppGpp. Derfor tjener disse proteiner som negative kontroller ved kvantificering af bindingsfraktionerne (figur 3).
Produktionen af renere 32P-mærket pppGpp og ppGpp er også afgørende for DRaCALA screening. For eksempel kan konverteringsforholdet fra GTP til pppGpp variere. Det er derfor vigtigt at optimere pH, koncentrationerne af magnesium og anvendte enzymer og reaktionstiden. Små reaktioner er derfor vigtige for at identificere den bedste tilstand, før der iværksættes en storstilet reaktion.
DRaCALA klart har nogle fordele og ulemper (se Roelofs et al.9 for mere diskussion) i forhold til andre teknikker såsom fangst sammensatte teknik. For det første anvender DRaCALA de 32P-mærkede (p)ppGpp, som ikke påvirker den kemiske struktur af (p)ppGpp, og derved bevarer sin interaktion med potentielle målproteiner. For det andet, når de 32p-(p) ppGpp og celle lysater er udarbejdet, det tager kun en uge at screene ~ 60 plader af E. coli ORFeome bibliotek ved hjælp af DRaCALA. Faktisk gjorde den korte forsøgsprocedure (afsnit 4) det muligt at identificere selv de proteiner, der nedbryder (p)ppGpp (MutT, NudG)12,17, som indfangningsforbindelsesteknikken gik glip af18.
Brugen af DRaCALA kræver dog et ORFeome-udtryksbibliotek, som kun er tilgængeligt for et begrænset antal modelorganismer. Desuden påvirker affinitetsrensningsmærkerne, der er designet til at lette proteinrensning i ORFeome-biblioteket, undertiden udtrykket eller korrekt foldning af proteinerne og producerer nogle falske negativer. Et nyt ORFeome-bibliotek vil ideelt set kræve, at det afgøres, om størstedelen (>80%) af proteinerne udtrykkes i opløselig form og i tilstrækkelige mængder. En sådan test giver også forskerne mulighed for at evaluere dækningen og effektiviteten af DRaCALA screeningsresultater.
På trods af disse begrænsninger er DRaCALA en kraftfuld teknik til med succes at afdække nye målproteiner fra flere nukleotid sekundære budbringere. I princippet kunne DRaCALA bruges til at studere enhver lille ligand, hvis den kunne mærkes ved hjælp af enten radioaktive isotoper eller endda fluorescerende farvestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet støttes af et NNF-projekttilskud (NNF19OC0058331) til YEZ og EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen (Nº 801199) til MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
