Summary
Differensial radial kapillærvirkning av Ligand Assay (DRaCALA) kan brukes til å identifisere små ligandbindende proteiner av en organisme ved hjelp av et ORFeome-bibliotek.
Abstract
Det siste tiåret har det vært en enorm fremgang i forståelsen av små signalmolekyler i bakteriefysiologi. Spesielt er målproteinene til flere nukleotidavledede sekundærbud (NSMer) systematisk identifisert og studert i modellorganismer. Disse prestasjonene skyldes hovedsakelig utviklingen av flere nye teknikker, inkludert fangstsammensetningsteknikken og differensial radial kapillærvirkning av ligandanalyse (DRaCALA), som ble brukt til systematisk å identifisere målproteiner av disse små molekylene. Dette dokumentet beskriver bruken av NSMer, guanosin penta- og tetrafosfater (p)ppGpp, som et eksempel og en videodemonstrasjon av DRaCALA-teknikken. Ved hjelp av DRaCALA ble 9 av 20 kjente og 12 nye målproteiner av (p)ppGpp identifisert i modellorganismen, Escherichia coli K-12, som demonstrerer kraften i denne analysen. I prinsippet kan DRaCALA brukes til å studere små ligander som kan merkes av radioaktive isotoper eller fluorescerende fargestoffer. De kritiske trinnene, fordelene og ulempene ved DRaCALA diskuteres her for videre bruk av denne teknikken.
Introduction
Bakterier bruker flere små signalmolekyler for å tilpasse seg stadig skiftende miljøer1,2. For eksempel, autoindusere, N-acylhomoserine laktoser og deres modifiserte oligopeptider, formidler intercellulær kommunikasjon blant bakterier for å koordinere befolkningsadferd, et fenomen kjent som quorum sensing2. En annen gruppe små signalmolekyler er NSM-ene, inkludert det mye studerte sykliske adenosinmonofosfatet (cAMP), syklisk di-AMP, syklisk di-guanosinmonofosfat (syklisk di-GMP) og guanosin penta- og tetrafosfater (p)ppGpp1. Bakterier produserer disse NSM-ene som et svar på en rekke ulike stressforhold. Når de er produsert, binder disse molekylene seg til sine målproteiner og regulerer flere forskjellige fysiologiske og metabolske veier for å takle de påløpkede påkjenningene og forbedre bakteriell overlevelse. Derfor er identifisering av målproteinene en uunngåelig forutsetning for å dechiffrere molekylære funksjoner til disse små molekylene.
Det siste tiåret har vært vitne til en boom av kunnskap om disse små signalmolekylene, hovedsakelig på grunn av flere tekniske innovasjoner som avduket målproteinene til disse små molekylene. Disse inkluderer fangstsammensetningsteknikken3,4,5og differensial radial kapillærvirkning av ligandanalyse (DRaCALA)6 som skal diskuteres i dette dokumentet.
Oppfunnet av Vincent Lee og medarbeidere i 20116, DRaCALA distribuerer evnen til en nitrocellulosemembran til differensialt sequester frie og proteinbundne ligander. Molekyler som proteiner kan ikke spre seg på en nitrocellulosemembran, mens små ligander, som NSM-ene, er i stand til det. Ved å blande NSM (f.eks.ppGpp) med proteinet som skal testes og oppdage dem på membranen, kan to scenarier forventes (Figur 1): Hvis (p)ppGpp binder seg til proteinet, vil den radiomerkede (p)ppGpp beholdes i midten av stedet av proteinet og vil ikke spre seg utover, noe som gir en intens liten prikk (dvs. radioaktivt signal) under en fosforimager. Men hvis (p)ppGpp ikke binder seg til proteinet, vil det spre seg fritt utover for å produsere et stort sted med ensartet bakgrunn radioaktivt signal.
Videre kan DRaCALA oppdage samspillet mellom et lite molekyl og et uoppgjort protein i en hel cellelyse hvis proteinet er tilstede i tilstrekkelig mengde. Denne enkelheten gjør det mulig å bruke DRaCALA i raskt å identifisere proteinmål ved hjelp av et ORFeome-uttrykksbibliotek. Faktisk er målproteiner av cAMP7, syklisk di-AMP8, syklisk di-GMP9,10og (p) ppGpp11,12,13 systematisk identifisert ved hjelp av DRaCALA. Denne videoartikkelen bruker (p)ppGpp som et eksempel for å demonstrere og beskrive de kritiske trinnene og vurderingene ved å utføre en vellykket DRaCALA-screening. Vær oppmerksom på at en grundigere beskrivelse av DRaCALA14 anbefales på det sterkeste å lese i kombinasjon med denne artikkelen før du utfører DRaCALA.
Figur 1: Prinsippet om DRaCALA. (A) Skjematisk for DRaCALA-analysen. Se teksten hvis du vil ha mer informasjon. (B) Kvantifisering og beregning av bindingsfraksjonen. Se teksten hvis du vil ha mer informasjon. Kort sagt vil DRaCALA-flekkene bli analysert ved å tegne to sirkler som omskriver hele stedet og den indre mørke prikken (dvs.beholdt (p) ppGpp på grunn av bindingen av det testede proteinet). Det spesifikke bindingssignalet er det radioaktive signalet til den indre sirkelen (S1) etter at det ikke-spesifikke bakgrunnssignalet er trukket fra (beregnet med A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindingsfraksjonen er det spesifikke bindingssignalet delt på det totale radioaktive signalet (S2). Forkortelser: DRaCALA = Differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosin penta- og tetrafosfater; RT = romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av hele cellelysater
- Inokuler E. coli K-12 ASKA ORFeome-kolleksjonenstammer 15 til 1,5 ml Lysogeny buljong (LB) som inneholder 25 μg/ml kloramfenikol i 96-brønns dype brønnplater. Vokse over natten (O / N) i 18 timer ved 30 °C med risting ved 160 o/min. Neste dag legger du til isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (endelig 0,5 mM) til O/N-kulturene for å indusere proteinuttrykk ved 30 °C i 6 timer.
- Pelletsceller på 500 x g i 10 min. Frys pelletsene ved -80 °C til bruk. For å lyse cellene, tilsett 150 μL lysisbuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, supplert med 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 40 μg/ml DNase 1 og 0,5 mg/ml lysozym) for å resuspendere pellet.
- Frys cellene ved -80 °C i 30 minutter, og tine deretter ved 37 °C i 20 minutter. Gjenta denne syklusen tre ganger for å lyse cellene. Oppbevar lysene ved -80 °C før bruk.
2. Rensing av Relseq og GppA
MERK: De rekombinante proteinene Relseq fra Streptococcus equisimilis og GppA fra E. coli K-12 brukes til å syntetisere henholdsvis radiomerket pppGpp og ppGpp.
- Vokse og samle celler som overekspresserer hvert protein.
- Utvid E. coli BL21 DE3-stammen opp til eksponentiell fase (optisk tetthet (OD) ~ 0,3-0,4) i LB-kjøttkraft, og spinn ned 1 ml kultur ved 6000 x g i 5 minutter. Dekanter supernatanten, og resuspender cellene med 100 μL iskald TSB-buljong (LB-buljong supplert med 0,1 g/ml PEG3350, 0,05 ml/ml dimetylsulfoksid, 20 mM MgCl2).
- Bland plasmidene som bærer histidinmerket relseq og gppA, hver 100 ng, med de ovennevnte cellefjæringene i TSB, og inkuber på is i 30 minutter. Varmsjokk cellene ved 42 °C i 40 s. Plasser blandingen på is i 2 min, og tilsett 1 ml LB buljong ved romtemperatur slik at cellene kan komme seg i 1 time ved 37 °C med agitasjon ved 160 o/min.
- Plate de gjenvunne cellene på LB agar plater supplert med tilsvarende antibiotika (Relseq:100 μg / ml ampicillin; GppA: 30 μg/ml kanamycin). Neste dag inokulerer du koloniene i LB-kjøttkraft for å starte O/N-prekulturer av begge stammene ved 37 °C.
- Etter 18 timer inokulerer du 500 ml LB-medium med 10 ml O/N-kulturer og tilsvarende antibiotika. Dyriser kulturene ved å riste ved 160 o/min ved 37 °C. Når OD600nm når 0,5-0,7, induser proteinuttrykk ved å tilsette 0,5 mM IPTG og vokse i 3 timer ved 30 °C med risting ved 160 o/min.
- Samle cellene ved å spinne ved 6084 x g i 10 min ved 4 °C. Resuspend pellet i 20 ml iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS), og re-sentrifuge ved 1912 x g i 20 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten, og frys pelletsene ved -20 °C før bruk.
- Nikkel-nitrilotria eddiksyre (Ni-NTA) affinitet rensing
MERK: Fra dette tidspunktet og fremover må du sørge for at prøvene er kalde.- Tilsett 40 ml iskald lysisbuffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % glyserol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoetanol supplert med proteasehemmere (EDTA-fri tablett; se materialtabellen) for å resuspend pellet. Lyse cellene via sonikering (60% amplitude, 2 s ON / 4 s OFF i 8 min PÅ). Fjern lysatet ved å spinne på 23 426 x g i 40 min ved 4 °C, og fortsett med supernatanten for rensing.
- Under ovennevnte sentrifugering, forberede Ni-NTA harpiks.
- Overfør 500 μL homogenisert Ni-NTA harpiks til en stående polypropylenkromatografikolonne, og la den slå seg til ro i 15 minutter og lagringsløsningen renne gjennom. Vask harpiksen med 15 ml ultrarent vann to ganger, og vask deretter kolonnen med 15 ml lysisbuffer L2.
- Last den fjernede supernatanten av cellelys fra trinn 1 til kolonnen, og la den strømme gjennom. Vask kolonnen med 30 ml vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glyserol, 20 mM imidazol).
- Elute proteiner med 400 μL av elution buffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glyserol, 500 mM imidazol) tre ganger. Gjenta deretter elution med ytterligere 300 μL av elutionbufferen. Kombiner de eluterte proteinene til et endelig volum på 700 μL.
- Gelfiltrering
- Forbered gelfiltreringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glyserol). Vask størrelsesekskluderingskolonnen med ett kolonnevolum (25 ml) av gelfiltreringsbufferen.
- Last inn den ovennevnte 700 μL-prøven ved å bruke en 500 μL sløyfe, kjør på 0,5 ml / min, og samle 2-3 fraksjoner, hver av 0,5 ml volum, som inneholder de respektive proteinene.
- Kombiner og konsentrer fraksjonene som inneholder hvert av proteinene ved hjelp av en spinnkolonne, og mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen.
3. Syntese av 32P-merkede pppGpp og ppGpp
- Monter en liten Relseq-reaksjon i et skruehettrør (se tabell 1).
MERK: Arbeid kun med radioaktive reagenser på et lisensiert sted og med personlig verneutstyr.
| Volum (μL) | ||
| Liten skala | Stor skala | |
| Ultrarent vann | ||
| 10x Relseq-buffer* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM finale) | ||
| Relseq (4 μM-finale) | ||
| 32 P-α-Guanosin tripfosfat (GTP) (siste 120 nM) (FORSIKTIG) | 0.2 | 5 |
| total | 20 | 500 |
Tabell 1: Montering av informasjon for små og store syntesereaksjoner av 32P-merkede pppGpp. *10x Relseq buffer inneholder 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Forkortelse: pppGpp = guanosin pentaphosphate.
- Inkuber røret ved 37 °C i en termomixer i 1 t, deretter ved 95 °C i 5 minutter, og legg det på is i 5 minutter. Spinn ned det utfelte proteinet på 15 700 x g i 5 min, og overfør supernatanten (syntetisert 32P-pppGpp) til et nytt skruehettrør.
- For å syntetisere 32P-ppGpp fra 32P-pppGpp, overfør halvparten av 32p-pppGpp-produktet til et nytt skruehettrør, og tilsett 1 μM GppA. Inkuber røret ved 37 °C i 10 minutter, ved 95 °C i 5 minutter, og legg det deretter på is i 5 minutter.
- Spinn ned det utfelte proteinet på 15 700 x g i 5 minutter, og overfør supernatanten (syntetisert 32P-ppGpp) til et nytt skruehettrør.
- Analyser 32P-pppGpp og 32P-ppGpp ved å kjøre 1 μL av prøvene på en TLC-plate (thin layer chromatography) (polyetylenimine-modifiserte cellulose TLC-plater) ved hjelp av 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, som mobilfase.
MERK: Bruk α-32P-merket guanosin 5'-tripfosfat (32P-α-GTP) som kontroll. - Tørk TLC-platen helt, plasser den mellom en gjennomsiktig plastmappe, og utsett den for en lagringsfosforskjerm i 5 minutter. Visualiser og kvantifisere signalene ved hjelp av en fosforimager.
MERK: Når forholdet mellom 32P-pppGpp og 32P-ppGpp er høyere enn 85 %, kan en storstilt reaksjon (500 μL, tilstrekkelig for screening av 20 96-brønnsplater) monteres og syntetiseres ved hjelp av tabell 1.
4. DRaCALA-screening av målproteinene til (p)ppGpp
- Tine og overfør 20 μL hele cellelys til en 96-brønns V-bunn mikrotiterplate. Tilsett 2,5 U/brønn endonuklease fra Serratia marcescens, og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for å redusere lysate viskositet. Plasser lysatene på is i 20 min.
- Bland 32P-pppGpp og 32P-ppGpp i forholdet 1:1, og tilsett 1x lysisbuffer L1 for å gjøre den endelige konsentrasjonen av (p)ppGpp lik 4 nM.
MERK: Gitt den kjemiske likheten mellom pppGpp og ppGpp, vil en blanding av begge kjemikaliene forenkle screeningprosessen. - Bruk en flerkanals pipette og filtrerte pipettespisser for å legge til og blande 10 μL av (p)ppGpp-blandingen med cellelyset. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 5 min.
- Vask verktøyet på 96 x pinne ved å plassere det i 0,01 % oppløsning av ikke-ionisk vaskemiddel i 30 s, og tørk på et papir i 30 s. Gjenta vaskingen av stiftverktøyet 3x.
- Plasser stiftverktøyet i de ovennevnte 96-brønns prøveplatene, og vent i 30 s. Løft stiftverktøyet rett opp, og plasser det rett ned på en nitrocellulosemembran i 30 s.
MERK: Hvis det mangler et sted, må du se 2 μL av de tilsvarende prøvene med pipette og filtrerte spisser. Det anbefales å lage et duplikatpunkt av samme prøve som angitt nedenfor. - Tørk membranen i 5 min ved RT. Plasser membranen mellom en gjennomsiktig plastmappe, og utsett den for en lagringsfosforskjerm i 5 min. Visualiser ved hjelp av en fosforimager.
5. Kvantifisering og identifisering av potensielle målproteiner
- Bruk analyseprogramvaren knyttet til fosforimageren til å åpne .gel-filen til de visualiserte platene. Bruk matriseanalysefunksjonen til å definere de 96 flekkene ved å definere et rutenett på 12 kolonner x 8 rader.
- Definer store sirkler for å omskrive ytterkanten av hele flekkene (se figur 1B). Eksporter Volumn+Bakgrunn og område for de definerte store sirklene, og lagre i et regneark.
MERK: Om nødvendig omplasserer du hver enkelt sirkel slik at den overlapper perfekt med flekkene, og endrer størrelsen på hver enkelt sirkel for å gjøre den litt større enn det faktiske stedet. - Endre størrelsen på de definerte sirklene for å omskrive de små indre prikkene. Eksporter Volumn+Bakgrunnog Område for de definerte små sirklene, og lagre i et regneark.
- Beregn bindingsbrøkene i regnearket ved hjelp av formelen i Figur 1B, og tegn inn dataene. Identifiser de potensielle bindende proteinene i brønnene som viser høye bindende fraksjoner sammenlignet med de fleste andre brønner.
Figur 2: Samlet arbeidsflyt for DRaCALA-screeningprosessen. Proteinproduksjon fra en Escherichia coli ASKA-kolleksjon er indusert, og cellene lyser. I mellomtiden er de rekombinante proteinene Relseq-His og GppA-His renset og brukt til å syntetisere 32P-merkede pppGpp og ppGpp fra 32P-α-GTP. De radioaktivt merkede (p)ppGpp-molekylene blandes deretter med lysatene, og et 96 pin-verktøy brukes til å oppdage blandingene på en nitrocellulosemembran for etterfølgende eksponering for en fosforlagringsskjerm, avbildning og kvantifisering av radioaktive signaler. Forkortelser: DRaCALA = Differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosin penta- og tetrafosfater; RT = romtemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-tripfosfat; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat-polyakrylamid gel elektroforese ; TLC = tynn lagkromatografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis du følger den ovenfor beskrevne protokollen, får du vanligvis to typer resultater (figur 3).
Figur 3A viser en plate med relativt lave bakgrunnsbindingssignaler (bindende fraksjoner < 0,025) fra de fleste brønnene. Det positive bindingssignalet fra brønn H3 gir en bindende brøkdel på ~0,35 som er mye høyere enn det som er observert for de andre brønnene. Selv uten kvantifisering er brønn H3 bemerkelsesverdig, noe som tyder på at et målprotein uttrykt i brønn H3 binder seg til enten pppGpp, ppGpp eller begge deler. Faktisk er proteinet overekspressert i brønn H3 hypoxanthine fosforibosyltransferase Hpt, som er kjent for å binde (p) ppGpp12,16.
Figur 3: Representative DRaCALA-screeningplater (til venstre) og kvantifisering (til høyre). (A) DRaCALA-flekkene på ASKA Plate-50. Det eneste positive treffet, Hpt, ga et sterkt bindende signal som stod ut både på stedet og i kvantiseringsdiagrammet. (B,C) To replikerer DRaCALA-flekker på den omorganiserte platen 31. Svarte brutte sirkler og piler angir de sanne målproteinene til (p)ppGpp, mens de røde brutte sirklene indikerer de falske positive. Se teksten hvis du vil ha mer informasjon. Forkortelser: DRaCALA = Differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosin penta- og tetrafosfater; RT = romtemperatur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-tripfosfat; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat-polyakrylamid gel elektroforese ; TLC = tynn lagkromatografi; Hpt = hypoksantin fosforibosyltransferase; PrfC = peptidkjedeutløsningsfaktor RF3; NadR = NMN adenylyltransferase; HflX = oversettelses-GTPase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det andre typiske resultatet av screeningen er vist i figur 3B,C. I denne platen viste flere brønner relativt høyere bakgrunnsbindingssignaler enn i figur 3A. Dette er godt synlig fra de relativt sterke indre prikkene for mange brønner. Kvantifisering viste også at mange brønner har bindende fraksjoner i området 0,02-0,04. En høyere bakgrunn av bindingssignalet er sannsynligvis forårsaket av at hele cellelysatet er viskøs til tross for behandlinger med både DNase I og endonuclease fra S. marcescens, som forringer det frigjorte kromosomale DNA. For plater som denne er det viktig å sammenligne de to replikeringsflekkene på platen (trinn 4.5; Figur 3B;C). Kvantifisering av begge platene viser at de autentiske positive målene (svarte sirkler, brønner A10 PrfC, B11 NadR) har en tendens til å gi konsekvent høye bindende fraksjoner.
Spesielt kan noen sanne mål også gi variable bindingsfraksjoner (Brønn D5, HflX12) for eksempel falske positiver (røde sirkler). Årsaken til denne variasjonen ligger i det faktum at ikke alle proteiner i et bibliotek uttrykkes i løselig form og i nødvendige mengder. Hvis konsentrasjonen av et protein er nær eller like under K d-verdien, kan variable bindingsresultater forventes, selv for de sanne målene. Faktisk ble store mengder oppløselig HflX-protein ikke oppnådd fra ASKA-stammen12. For å avgjøre om disse proteinene er sanne bindemidler eller ikke, må de potensielle proteinene renses til homogenitet og bindingen bekreftes ved å bruke en høyere konsentrasjon (50-100 μM) av proteinene.
Via denne screeningen ble 9 av 20 kjente målproteiner av (p)ppGpp12 identifisert (se diskusjonsdelen), noe som validerer nytten av DRaCALA for denne oppgaven. I tillegg ble 12 nye mål for (p)ppGpp oppdaget og bekreftet, noe som viser at DRaCALA er en kraftig teknikk for å avdekke nye målproteiner av (p)ppGpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et av de kritiske trinnene for å utføre DRaCALA-screening er å oppnå gode hele cellelys. For det første bør de testede proteinene produseres i store mengder og i oppløselige former. For det andre bør lysis av celler være komplett, og lysatets viskositet må være minimal. Inkluderingen av lysozyme og bruk av tre sykluser med fryse-tining er ofte nok til å lyse celler helt. Imidlertid gjør det frigjorte kromosomale DNA lysatet viskøs og genererer høy bakgrunnsbindingssignal, noe som resulterer i falske positiver som vist i figur 3B,C. For å redusere dette kan DNase 1 og/eller endonuclease fra S. marcescens brukes, og prøvene kan inkuberes i lengre tid for å forringe DNA-et.
Både negative (tomme plasmidvektorer) og positive (kjente målprotein) kontroller bør brukes til å optimalisere betingelsene for helcellelysepreparat og DRaCALA-bindingsanalysen før du utfører en storskala screening. Når en slik optimal tilstand er funnet, blir det unødvendig å inkludere kontrollene i selve screeningen av hver plate. Dette er fordi screeningprosedyren er svært kort, og fordi flertallet av proteinene i en tallerken forventes å ikke binde seg til (p) ppGpp. Derfor tjener disse proteinene som negative kontroller når bindingsfraksjonene kvantifiseres (figur 3).
Produksjon av renere 32P-merkede pppGpp og ppGpp er også avgjørende for DRaCALA-screening. Konverteringsforholdet fra GTP til pppGpp kan for eksempel variere. Dermed er det viktig å optimalisere pH, konsentrasjonene av magnesium og enzymer som brukes, og reaksjonstiden. Små reaksjoner er derfor viktige for å identifisere den beste tilstanden før du setter opp en storstilt reaksjon.
DRaCALA har tydeligvis noen fordeler og ulemper (se Roelofs et al.9 for mer diskusjon) sammenlignet med andre teknikker som fangst sammensatt teknikk. For det første bruker DRaCALA 32P-merket (p)ppGpp, som ikke påvirker den kjemiske strukturen til (p)ppGpp, og dermed bevarer samspillet med potensielle målproteiner. For det andre, når 32p-(p)ppGpp og cellelysater er forberedt, tar det bare en uke å screene ~ 60 plater av E. coli ORFeome-biblioteket ved hjelp av DRaCALA. Faktisk tillot den korte eksperimentelle prosedyren (avsnitt 4) identifisering av selv proteiner som forringer (p) ppGpp (MutT, NudG)12,17, som fangstsammensetningsteknikken savnet18.
Bruken av DRaCALA krever imidlertid et ORFeome-uttrykksbibliotek, som bare er tilgjengelig for et begrenset antall modellorganismer. Dessuten påvirker affinitetsrensingskodene, som er designet for å lette proteinrensing i ORFeome-biblioteket, noen ganger uttrykket eller riktig folding av proteinene, og produserer noen falske negativer. Et nytt ORFeome-bibliotek vil ideelt sett kreve besluttsomhet om hvorvidt flertallet (>80%) av proteinene uttrykkes i løselig form og i tilstrekkelige mengder. En slik test gjør det også mulig for forskerne å evaluere dekningen og effektiviteten av DRaCALA-screeningresultatene.
Til tross for disse begrensningene er DRaCALA en kraftig teknikk for å lykkes med å avdekke nye målproteiner av flere nukleotid sekundære budbringere. I prinsippet kan DRaCALA brukes til å studere en hvilken som helst liten ligand hvis den kan merkes ved å bruke enten radioaktive isotoper eller til og med fluorescerende fargestoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet støttes av et NNF Project Grant (NNF19OC0058331) til YEZ, og EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen (Nº 801199) til MLS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
