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Biochemistry

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62331
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन का उपयोग ओआरफेम लाइब्रेरी का उपयोग करके किसी जीव के छोटे लिगांड बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

पिछले दशक में बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में छोटे सिग्नलिंग अणुओं की समझ में जबरदस्त प्रगति देखी गई है । विशेष रूप से, कई न्यूक्लियोटाइड-व्युत्पन्न माध्यमिक दूतों (एनएसएम) के लक्षित प्रोटीन की व्यवस्थित रूप से पहचान की गई है और मॉडल जीवों में अध्ययन किया गया है। ये उपलब्धियां मुख्य रूप से कैप्चर कंपाउंड तकनीक और लिगांड परख (DRaCALA) की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई सहित कई नई तकनीकों के विकास के कारण हैं, जिनका उपयोग इन छोटे अणुओं के लक्षित प्रोटीन की व्यवस्थित रूप से पहचान करने के लिए किया जाता था। यह पत्र DRaCALA तकनीक के उदाहरण और वीडियो प्रदर्शन के रूप में एनएसएम, ग्वानोसाइन पेंटा-और टेट्राफॉस्फेट (पी) पीपीजीपीपी के उपयोग का वर्णन करता है। DRaCALA का उपयोग करना, 20 ज्ञात में से 9 ज्ञात और (पी) पीपीजीपीपी के 12 नए लक्ष्य प्रोटीन मॉडल जीव, एस्चेरिचिया कोलाई K-12 में पहचाने गए थे, जो इस परख की शक्ति का प्रदर्शन करते हैं। सिद्धांत रूप में, DRaCALA का उपयोग छोटे लिगामेंट्स का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिन्हें रेडियोधर्मी आइसोटोप या फ्लोरोसेंट रंगों द्वारा लेबल किया जा सकता है। इस तकनीक के आगे आवेदन के लिए DRaCALA के महत्वपूर्ण कदम, पेशेवरों और विपक्ष पर चर्चा की जाती है।

Introduction

बैक्टीरिया लगातार बदलते वातावरण के अनुकूल होने के लिए कई छोटे संकेत अणुओं का उपयोग करते हैं1,2. उदाहरण के लिए, ऑटोइंडर्स, एन-एकिलहोमोसेरीन लैक्टोन और उनके संशोधित ओलिगोपेप्टाइड्स, जनसंख्या व्यवहार को समन्वित करने के लिए बैक्टीरिया के बीच अंतरकोशिकीय संचार में मध्यस्थता करते हैं, एक घटना जिसे कोरम संवेदन2के रूप में जाना जाता है। छोटे सिग्नलिंग अणुओं का एक अन्य समूह एनएसएम है, जिसमें व्यापक रूप से अध्ययन किया गया साइक्लिक एडेनोसाइन मोनोफोस्फेट (सीएएमपी), चक्रीय डी-एएमपी, साइक्लिक डी-ग्वानोसाइन मोनोफॉस्फेट (चक्रीय डी-जीएमपी), और ग्वानोसाइन पेंटा-और टेट्रा फॉस्फेट (पी) पीपीजीपी1शामिल हैं। बैक्टीरिया विभिन्न तनाव की स्थिति की एक प्रतिक्रिया के रूप में इन NSMs का उत्पादन। एक बार उत्पादित होने के बाद, ये अणु अपने लक्षित प्रोटीन से बांधते हैं और सामने आए तनावों से निपटने और बैक्टीरियल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए कई अलग-अलग शारीरिक और मेटाबोलिक रास्तों को विनियमित करते हैं। इसलिए, इन छोटे अणुओं के आणविक कार्यों को समझने के लिए लक्षित प्रोटीन की पहचान एक अपरिहार्य शर्त है ।

पिछले दशक में इन छोटे संकेत अणुओं के ज्ञान का बूम देखा गया है, मुख्य रूप से कई तकनीकी नवाचारों के कारण है कि इन छोटे अणुओं के लक्ष्य प्रोटीन का अनावरण किया । इनमें कैप्चर कंपाउंड तकनीक3,4,5,और लिगांड परख (DRaCALA) 6 की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाईशामिल है जो इस पेपर में चर्चा की जानी है।

20116में विंसेंट ली और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा आविष्कार किया गया, DRaCALA एक नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली की क्षमता को अलग-अलग तनहा मुक्त और प्रोटीन-बाध्य लिगांड के लिए तैनात करता है। प्रोटीन जैसे अणु नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर फैला नहीं सकते, जबकि एनएसएम जैसे छोटे लिगामेंट्स कर सकते हैं । एनएसएम(जैसे,पीपीजीपी) को प्रोटीन के साथ मिलाकर, दो परिदृश्यों की उम्मीद की जा सकती है(चित्र 1): यदि(पी) पीपीजीपी प्रोटीन से बांधता है, तो रेडियोलेबल (पी) पीपीजीपी को प्रोटीन द्वारा स्थान के केंद्र में रखा जाएगा और बाहरी रूप से फैलाना नहीं होगा, जिससे एक तीव्र छोटी डॉट(यानी., एक फॉस्फोरमगर के नीचे मजबूत रेडियोधर्मी संकेत) । हालांकि, अगर (पी) ppGpp प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं करता है, यह स्वतंत्र रूप से जावक फैलाना करने के लिए एक समान पृष्ठभूमि रेडियोधर्मी संकेत के साथ एक बड़े स्थान का उत्पादन होगा ।

इसके अलावा, DRaCALA एक छोटे से अणु और एक पूरी कोशिका में एक अशुद्ध प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगा सकते है अगर प्रोटीन एक पर्याप्त मात्रा में मौजूद है । यह सादगी एक ORFeome अभिव्यक्ति पुस्तकालय का उपयोग करके तेजी से प्रोटीन लक्ष्यों की पहचान करने में DRaCALA के उपयोग की अनुमति देता है । दरअसल, DRACALA का उपयोग करके सीएएएमपी7,चक्रीय डी-एएमपी8,चक्रीय दी-जीएमपी9,10,और (पी) पीपीजीपी11,12,13 के लक्षित प्रोटीन को व्यवस्थित रूप से पहचाना गया है। यह वीडियो लेख एक सफल DRaCALA स्क्रीनिंग प्रदर्शन में महत्वपूर्ण कदमों और विचारों को प्रदर्शित करने और वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में (पी) पीपीजीपीपी का उपयोग करता है। ध्यान दें, DRaCALA14 का अधिक गहन विवरण DRaCALA प्रदर्शन करने से पहले इस लेख के साथ संयोजन में पढ़ने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1:DRaCALA का सिद्धांत। (A)DRaCALA परख की योजनाबद्ध । विवरण के लिए पाठ देखें। (ख)बाध्यकारी अंश की मात्राकरण और गणना । विवरण के लिए पाठ देखें। संक्षेप में, DRaCALA स्पॉट दो हलकों कि पूरे स्थान और भीतरी अंधेरे डॉट(यानी, बनाए रखा (पी) परीक्षण प्रोटीन के बाध्यकारी के कारण ppGpp परिमाक्रय ड्राइंग द्वारा विश्लेषण किया जाएगा । विशिष्ट बाध्यकारी संकेत गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत को घटाने के बाद इनर सर्कल (S1) का रेडियोधर्मी संकेत है (एक1 × ((एस 2-एस1)/(ए2-ए1))))द्वारा गणना की जाती है। बाध्यकारी अंश कुल रेडियोधर्मी संकेत (S2) द्वारा विभाजित विशिष्ट बाध्यकारी संकेत है। संक्षिप्त नाम: DRaCALA = लिगांड परख की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई; (p)ppGpp = गुआनोसिन पेंटा- और टेट्राफस्फेट; आर टी = कमरे का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. पूरे सेल की तैयारी

  1. ई. कोलाई कश्मीर-12 ASKA ORFeome संग्रह15 में उपभेदों १.५ mL Lysogeny शोरबा (पौंड) ९६ में 25 μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल युक्त-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेटें । 160 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए रात भर (O/N) बढ़ाएं। अगले दिन, ओ/एन संस्कृतियों में आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगालेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) (अंतिम ०.५ mM) जोड़ें ताकि 6 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जा सके ।
  2. 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर गोली कोशिकाएं। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों को फ्रीज करें। कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए, लाइसिस बफर एल1 (40 एमएम ट्रिस पीएच 7.5, के 150 माइक्रोल जोड़ें 100 mm NaCl, 10 mM MgCl2,2 mm फिनाइलमिथाइल्सल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), 40 μg/mL DNase 1, और 0.5 मिलीग्राम/एमएल लाइसोजिमे) के साथ पूरक गोली को फिर से खर्च करने के लिए।
  3. कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, और फिर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं। कोशिकाओं को lyse करने के लिए इस चक्र को तीन बार दोहराएं। उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर lysates स्टोर करें।

2. आरईएलसेक्यू और जीपीपीए का शुद्धिकरण

नोट: ई. कोलाई के-12 से स्ट्रेप्टोकोकस इक्विसिमिलिस और जीपीपीए से रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन रिन्डएसईक्यू का उपयोग क्रमशः रेडियोलेबल पीपीपीजीपीपी और पीपीजीपीपी से संश्लेषित करने के लिए किया जाता है।

  1. प्रत्येक प्रोटीन को अधिक बढ़ाएं और एकत्र करें।
    1. एलबी शोरबा में घातीय चरण (ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) ~ 0.3-0.4) तक ई. कोलाई BL21 DE3 तनाव बढ़ाएं, और 5 मिनट के लिए 6000 x ग्राम पर संस्कृति के 1 एमएल नीचे स्पिन करें। सुपरनैंट को डिसेंट करें, और 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से ढंकें-ठंडा टीएसबी शोरबा (एलबी शोरबा 0.1 ग्राम/एमएल PEG3350, 0.05 एमएल/एमएल डिमेथाइल्सुफॉक्साइड, 20 एमएम एमजीसीएल2)के साथ पूरक है।
    2. टीएसबी में उपरोक्त सेल निलंबन के साथ, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट के साथ, हिस्टिडीन-टैग किए गए रीलसेक्यू और जीपीपीए,प्रत्येक 100 एनजी वाले प्लाज्मिड्स को मिलाएं। गर्मी-40 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को झटका। मिश्रण को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, और कमरे के तापमान पर एलबी शोरबा का 1 मिलियन जोड़ें ताकि कोशिकाओं को 160 आरपीएम पर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ठीक होने की अनुमति दी जा सके।
    3. प्लेट एलबी आगर प्लेटों पर बरामद कोशिकाओं इसी एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (Relseq:१०० μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin) । अगले दिन, एलबी शोरबा में कालोनियों को टीका लगाकर दोनों उपभेदों की ओ/एन प्रीकल्चर 37 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करें।
    4. 18 घंटे के बाद, ओ/एन संस्कृतियों और इसी एंटीबायोटिक दवाओं के 10 एमएल के साथ पौंड माध्यम के ५०० एमएल टीका । 37 डिग्री सेल्सियस पर 160 आरपीएम पर मिलाते हुए संस्कृतियों को बढ़ाएं। जब ओडी600 एनएम 0.5-0.7 तक पहुंचता है, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति को 0.5 एमएम आईपीटीजी जोड़कर प्रेरित करें और 160 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए बढ़ रहे हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6084 x ग्राम पर कताई करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें। बर्फ के 20 मिलीएल में गोली को फिर से खर्च करें-ठंडा 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1912 x g पर फिर से अपकेंद्रित्र। सुपरनैंट को डिकंट करें, और उपयोग से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों को फ्रीज करें।
  2. निकेल-नाइट्रोइट्रिएंटिसेटिक एसिड (नी-एनटीए) आत्मीयता शुद्धि
    नोट: इस बिंदु के बाद से, सुनिश्चित करें कि नमूने ठंडे हैं।
    1. बर्फ के 40 मिलीएल जोड़ें-ठंडा लाइसिस बफर L2 (50 mM Tris पीएच 7.5, 150 mm NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 10 mm इमिडाजोल, 10 mm β-mercaptoethanol प्रोटीज अवरोधकों (EDTA मुक्त गोली के साथ पूरक; सामग्री की मेजदेखें) पैलेट ऑफ मैटेलेटर को रीपेंडस को गोली दें। सोनीशन के माध्यम से कोशिकाओं Lyse (६०% आयाम, 2 एस पर/ 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 23,426 x ग्राम पर कताई करके lysate साफ करें, और शुद्धि के लिए सुपरनेटेंट जारी रखें।
    2. उपरोक्त अपकेंद्रित्र के दौरान, नी-एनटीए राल तैयार करें।
      1. एक खड़े पॉलीप्रोपाइलीन क्रोमेटोग्राफी कॉलम में समरूप नी-एनटीए राल के 500 माइक्रोन स्थानांतरित करें, और इसे 15 मिनट और भंडारण समाधान नाली के माध्यम से व्यवस्थित होने दें। राल को 15 एमएल अल्ट्रापुरे पानी से दो बार धोएं और फिर लाइसिस बफर एल2 के 15 एमएल से कॉलम धो लें ।
    3. सेल के क्लीयर सुपरनेट को चरण 1 से कॉलम पर लोड करें, और इसे प्रवाहित होने दें। 30 एमएल वाशिंग बफर (50 m Tris पीएच 7.5, 150 mM NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 20 mm इमिडाजोल) के साथ कॉलम धोएं।
    4. एल्यूशन बफर (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.5, 150 mm NaCl, 5% ग्लाइसरोल, 500 mm इमिडाजोल) के 400 माइक्रोन के साथ प्रोटीन तीन बार एल्यूट करें। फिर, एल्यूशन बफर के एक और 300 माइक्रोन के साथ संयुद्ध दोहराएं। एल्यूटेड प्रोटीन को 700 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में मिलाएं।
  3. जेल फिल्ट्रेशन
    1. जेल फिल्ट्रेशन बफर (50 mM Tris, पीएच 7.5; 200 mM NaCl; 5% ग्लिसरोल) तैयार करें। जेल फिल्ट्रेशन बफर के एक कॉलम वॉल्यूम (25 एमएल) के साथ आकार अपवर्जन कॉलम धोएं।
    2. 500 माइक्रोल लूप का उपयोग करके उपरोक्त 700 माइक्रोल नमूना लोड करें, 0.5 एमएल/न्यूनतम पर चलाएं, और संबंधित प्रोटीन युक्त 0.5 एमएल वॉल्यूम में से प्रत्येक 2-3 अंश एकत्र करें।
    3. एक स्पिन कॉलम का उपयोग कर प्रोटीन में से प्रत्येक युक्त अंशों को मिलाएं और केंद्रित करें, और ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।

3. 32पी-लेबल पीपीपीजीपीपी और पीपीजीपीपी का संश्लेषण

  1. एक स्क्रू कैप ट्यूब में एक छोटे पैमाने पर Relseq प्रतिक्रिया इकट्ठा (तालिका 1देखें) ।
    नोट: रेडियोधर्मी अभिकर्णों के साथ केवल एक लाइसेंस प्राप्त जगह में और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ काम करते हैं ।
वॉल्यूम (माइक्रोन)
लघु बड़े पैमाने पर
अल्ट्रापुरे पानी
10x Relseq बफर * 2 50
एटीपी (8 एमएमएम फाइनल)
Relseq (4 μएम फाइनल)
32 पी-α-गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) (अंतिम 120 एनएम) (सावधानी) 0.2 5
कुल 20 500

तालिका 1: 32पी-लेबल पीपीपीजीपी की छोटी और बड़े पैमाने पर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के लिए जानकारी कोडांतरण। * 10x रिलेक्यू बफर में 250 m M Tris-HCl, पीएच 8.6 शामिल हैं; 1M NaCl; 80 एमएमएल एमजीसीएल2. संक्षिप्त नाम: पीपीपीजीपी = गुआनोसिन पेंटाफॉस्फेट।

  1. 1 घंटे के लिए थर्मोमिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें, फिर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। 5 मिनट के लिए 15,700 x ग्राम पर उपजी प्रोटीन को स्पिन करें, और सुपरनैंट (संश्लेषित 32पी-पीपीपीपीपी) को एक नए स्क्रू कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 32पी-पीपीजीपीपी से 32पी-पीपीजीपीपी को संश्लेषित करने के लिए, 32पी-पीपीपीपीपी उत्पाद के आधे हिस्से को एक नए स्क्रू कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 1 माइक्रोन जीपीए जोड़ें। ट्यूब को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर, और फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. 5 मिनट के लिए 15,700 x ग्राम पर उपजी प्रोटीन को स्पिन करें, और सुपरनैंट (संश्लेषित 32पी-पीपीजीपी) को एक नए स्क्रू कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. मोबाइल चरण के रूप में 1.5एम केएच 2पीओ4, पीएच 3.4का उपयोग करके एक पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) प्लेट (पॉलीथीलीनीमाइन-संशोधित सेल्यूलोज टीएलसी प्लेट) पर नमूनों के 1 माइक्रोन चलाकर 32 पी-पीपीपीजीपी और32पी-पीपीजीपी का विश्लेषण करें।
    नोट: नियंत्रण के रूप मेंα-३२पी-लेबल वाले गुआनोसिन 5'-ट्रिप्होस्फेट(३२पी-α-जीटीपी) का उपयोग करें ।
  5. टीएलसी प्लेट को पूरी तरह से सुखा लें, इसे एक पारदर्शी प्लास्टिक फ़ोल्डर के बीच रखें, और इसे 5 मिनट के लिए स्टोरेज फॉस्फोर स्क्रीन पर बेनकाब करें। फॉस्फोरमगर का उपयोग करके संकेतों की कल्पना करें और मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: जब 32पी-पीपीपीजीपीपी और 32पी-पीपीजीपीपी का अनुपात 85% से अधिक होता है, तो बड़े पैमाने पर प्रतिक्रिया (500 माइक्रोन, स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त 20 96-अच्छी प्लेटें) को टेबल 1का उपयोग करके इकट्ठा और संश्लेषित किया जा सकता है।

4. (पी) ppGpp के लक्ष्य प्रोटीन की DRaCALA स्क्रीनिंग

  1. गल और पूरे सेल के 20 μL हस्तांतरण एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे माइक्रोटिटर प्लेट के लिए lysl । सेराटिया मार्केसेन्ससे 2.5 यू/वेल ऑफ एंडोन्यूक्लिज जोड़ें, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि lysate चिपचिपाहट को कम किया जा सके। 20 मिनट के लिए बर्फ पर lysates रखें।
  2. 1:1अनुपात में 32 पी-पीपीपीजीपी और 32पी-पीपीजीपी को मिलाएं, और 4 एनएम के बराबर (पी) पीपीजीपीपी की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1x लाइसिस बफर एल1 जोड़ें।
    नोट: pppGpp और ppGpp के बीच रासायनिक समानता को देखते हुए, दोनों रसायनों का मिश्रण स्क्रीनिंग प्रक्रिया को आसान बना देगा ।
  3. सेल लिसेट के साथ (पी) पीपीजीपीपी मिश्रण के 10 माइक्रोल को जोड़ने और मिलाने के लिए मल्टीचैनल पिपेट और फ़िल्टर किए गए पिपेट टिप्स का उपयोग करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट।
  4. 30 एस के लिए गैर आयनिक डिटर्जेंट के 0.01% समाधान में रखकर 96 x पिन टूल धोएं, और 30 एस के लिए एक ऊतक पेपर पर सूखें। पिन टूल 3x की धुलाई दोहराएं।
  5. पिन टूल को उपरोक्त 96-अच्छी तरह से नमूना प्लेटों में रखें, और 30 एस की प्रतीक्षा करें। पिन टूल को सीधे ऊपर उठाएं, और इसे सीधे 30 एस के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर रखें।
    नोट: यदि कोई स्थान गायब है, तो एक पिपेट और फ़िल्टर किए गए सुझावों के साथ संबंधित नमूनों के 2 μL रखें। नीचे दिए गए उसी नमूने का डुप्लीकेट स्पॉट बनाने की सलाह दी जाती है।
  6. आर टी में 5 मिनट के लिए झिल्ली को सुखाएं। झिल्ली को पारदर्शी प्लास्टिक फ़ोल्डर के बीच रखें, और इसे 5 मिनट के लिए स्टोरेज फॉस्फोर स्क्रीन पर बेनकाब करें। फॉस्फोरमगर का उपयोग करके कल्पना करें।

5. संभावित लक्ष्य प्रोटीन की मात्राकरण और पहचान

  1. कल्पना प्लेटों की .gel फ़ाइल खोलने के लिए फॉस्फोरमगर से जुड़े विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। 12 कॉलम x 8 पंक्तियों का ग्रिड स्थापित करके 96 स्पॉट को परिभाषित करने के लिए सरणी विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  2. पूरे स्थानों के बाहरी किनारे को दरकिनार करने के लिए बड़े हलकों को परिभाषित करें (चित्रा 1Bदेखें)। Volumn + पृष्ठभूमि और परिभाषित बड़े हलकों के क्षेत्र का निर्यात, और एक स्प्रेडशीट में बचाने के लिए ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक व्यक्तिगत सर्कल को स्पॉट के साथ पूरी तरह से ओवरलैप करने के लिए फिर से स्थान दें, और प्रत्येक व्यक्तिगत सर्कल का आकार बदलें ताकि इसे वास्तविक स्थान से थोड़ा बड़ा बनाया जा सके।
  3. छोटे आंतरिक बिंदुओं को दरकिनार करने के लिए परिभाषित हलकों का आकार। Volumn + पृष्ठभूमि,और परिभाषित छोटे हलकों के क्षेत्र का निर्यात करें, और एक स्प्रेडशीट में सहेजें।
  4. चित्रा 1Bमें समीकरण का उपयोग करके स्प्रेडशीट में बाध्यकारी अंशों की गणना करें, और डेटा को प्लॉट करें। कुओं में संभावित बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करें जो अधिकांश अन्य कुओं की तुलना में उच्च बाध्यकारी अंश दिखाते हैं।

Figure 2
चित्रा 2:DRaCALA स्क्रीनिंग प्रक्रिया का समग्र कार्यप्रवाह। एक एस्चेरिचिया कोलाई ASKA संग्रह से प्रोटीन उत्पादन प्रेरित है, और कोशिकाओं को lysed हैं । इस बीच, recombinant प्रोटीन Relseq-उसकेऔर GppA-अपने शुद्ध कर रहे है और ३२पी लेबल pppGpp और ppGpp ३२पी-α-GTP से संश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया । रेडियोधर्मी लेबल (पी) पीपीजीपी अणुओं को फिर लिसेट्स के साथ मिलाया जाता है, और एक 96 पिन-टूल का उपयोग मिश्रण को फॉस्फोर स्टोरेज स्क्रीन, इमेजिंग और रेडियोधर्मी संकेतों के मात्राकरण के बाद के जोखिम के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्पॉट करने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: DRaCALA = लिगांड परख की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई; (p)ppGpp = गुआनोसिन पेंटा- और टेट्राफस्फेट; आर टी = कमरे का तापमान; आईपीटीजी = आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगालेक्टोपायरानोसाइड; GTP = गुआनोसिन 5'-ट्रिप्होस्फेट; SDS-पेज = सोडियम डोडेसिल्सुफेट-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस; टीएलसी = पतली परत क्रोमेटोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

उपर्युक्त प्रोटोकॉल के बाद आमतौर पर दो प्रकार के परिणाममिलेंगे (चित्र 3)।

चित्रा 3A कुओं के बहुमत से अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेतों (बाध्यकारी अंश < ०.०२५) के साथ एक थाली से पता चलता है । अच्छी तरह से H3 से सकारात्मक बाध्यकारी संकेत ~ 0.35 का एक बाध्यकारी अंश देता है जो अन्य कुओं के लिए मनाए गए की तुलना में बहुत अधिक है। यहां तक कि मात्रा के बिना, अच्छी तरह से H3 उल्लेखनीय है, सुझाव है कि एक लक्ष्य प्रोटीन अच्छी तरह से H3 में व्यक्त या तो pppGpp, ppGpp, या दोनों के लिए बांधता है । दरअसल, अच्छी तरह से एच 3 में अधिक उत्साहित प्रोटीन हाइपोक्सेंथिन फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसफरीज एचपीटी है, जिसे (पी) पीपीजीपीपी12, 16को बांधने के लिए जानाजाताहै।

Figure 3

चित्रा 3:प्रतिनिधि DRaCALA स्क्रीनिंग प्लेटें (बाईं ओर) और मात्राकरण (दाईं ओर) ।(ए)ASKA प्लेट-५० के DRaCALA स्पॉट । केवल सकारात्मक हिट, Hpt, दोनों जगह और क्वांटिटेशन आरेख में बाहर खड़े एक मजबूत बाध्यकारी संकेत दिया । (B,C) पुनर्व्यवस्थित प्लेट 31 के दो दोहराने DRaCALA स्पॉट । काले टूटे हुए हलकों और तीर (पी) पीपीजीपीपी के सच्चे लक्ष्य प्रोटीन का संकेत देते हैं, जबकि लाल टूटे हुए सर्कल झूठे सकारात्मक संकेत देते हैं। विवरण के लिए पाठ देखें। संक्षिप्त नाम: DRaCALA = लिगांड परख की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई; (p)ppGpp = गुआनोसिन पेंटा- और टेट्राफस्फेट; आर टी = कमरे का तापमान; आईपीटीजी = आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगालेक्टोपायरानोसाइड; GTP = गुआनोसिन 5'-ट्रिप्होस्फेट; SDS-पेज = सोडियम डोडेसिल्सुफेट-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस; टीएलसी = पतली परत क्रोमेटोग्राफी; Hpt = हाइपोक्सेंथिन फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसफेरेज; पीआरएफसी = पेप्टाइड चेन रिलीज फैक्टर आरएफ 3; NadR = एनएमएन adenylyltransferase; HflX = अनुवाद GTPase। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्क्रीनिंग के अन्य विशिष्ट परिणाम चित्रा 3 बी,सीमें दिखाए गए हैं। इस थाली में, कई कुओं चित्रा 3Aमें उन लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेतों को दिखाया । यह कई कुओं के लिए अपेक्षाकृत मजबूत आंतरिक बिंदुओं से स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। परिमाणीकरण से यह भी पता चला है कि कई कुओं में 0.02-0.04 की सीमा में बाध्यकारी अंश हैं । बाध्यकारी संकेत की एक उच्च पृष्ठभूमि की संभावना पूरे सेल lysate दोनों DNase I और एस marcescensसे एंडोन्यूलेज के साथ उपचार के बावजूद चिपचिपा होने के कारण होता है, जो जारी क्रोमोसोमल डीएनए को नीचा दिखाता है। इस तरह के रूप में प्लेटों के लिए, यह थाली के दो दोहराने स्थानों की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है (चरण ४.५; चित्रा 3B,C)। दोनों प्लेटों के मात्राकरण से पता चलता है कि प्रामाणिक सकारात्मक लक्ष्य (काले घेरे, वेल्स A10 PrfC, B11 NadR) लगातार उच्च बाध्यकारी अंश देते हैं।

विशेष रूप से, कुछ सच्चे लक्ष्य भी चर बाध्यकारी अंश (वेल डी 5, एचएफएलएक्स12)जैसे झूठी सकारात्मक (लाल घेरे) दे सकते हैं। इस परिवर्तनशीलता का कारण इस तथ्य में निहित है कि पुस्तकालय में सभी प्रोटीन घुलनशील रूप में और आवश्यक मात्रा में व्यक्त नहीं किए जाते हैं। यदि प्रोटीन की एकाग्रता केडी मूल्य के करीब या ठीक नीचे है, तो सही लक्ष्यों के लिए भी चर बाध्यकारी परिणामों की उम्मीद की जा सकती है। दरअसल, एएसकेए स्ट्रेन12से बड़ी मात्रा में घुलनशील एचएफएलएक्स प्रोटीन प्राप्त नहीं किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि ये प्रोटीन सच्चे बांधने वाले हैं या नहीं, संभावित प्रोटीन को एकरूपता के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए और प्रोटीन की उच्च एकाग्रता (50-100 माइक्रोन) का उपयोग करके बाध्यकारी की पुष्टि की जानी चाहिए।

इस स्क्रीनिंग के माध्यम से, 20 में से 9 ज्ञात लक्ष्य प्रोटीन (पी) पीपीजीपीपी12 की पहचान की गई (चर्चा अनुभाग देखें), इस कार्य के लिए DRaCALA की उपयोगिता को मान्य किया गया। इसके अतिरिक्त, (पी) पीपीजीपीपी के 12 नए लक्ष्यों की खोज और पुष्टि की गई, यह प्रदर्शित करते हुए कि DRaCALA (पी) पीपीजीपीपी के उपन्यास लक्ष्य प्रोटीन को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है।

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Discussion

DRaCALA स्क्रीनिंग प्रदर्शन में महत्वपूर्ण चरणों में से एक अच्छा पूरे सेल lysates प्राप्त करने के लिए है । सबसे पहले, परीक्षण प्रोटीन बड़ी मात्रा में और घुलनशील रूपों में उत्पादित किया जाना चाहिए। दूसरा, कोशिकाओं की लाइसिस पूरी होनी चाहिए, और लाइसेट की चिपचिपाहट कम से कम होनी चाहिए। lysozyme का समावेश और फ्रीज-गल के तीन चक्रों का उपयोग अक्सर कोशिकाओं को पूरी तरह से lyse करने के लिए पर्याप्त होते हैं। हालांकि, जारी क्रोमोसोमल डीएनए lysate चिपचिपा बनाता है और उच्च पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेत उत्पन्न करता है, जिसके परिणामस्वरूप चित्रा 3 बी,सीमें दिखाया गया है। इसे कम करने के लिए, एस मार्सेसेन्स से DNase 1 और/या एंडोन्यूक्लिज का उपयोग किया जा सकता है, और डीएनए को नीचा दिखाने के लिए नमूनों को लंबे समय तक इनक्यूबेटेड किया जा सकता है ।

बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग करने से पहले पूरे सेल lysate तैयारी और DRaCALA बाध्यकारी परख के लिए शर्तों को अनुकूलित करने के लिए नकारात्मक (खाली प्लाज्मिड वेक्टर) और सकारात्मक (ज्ञात लक्षित प्रोटीन) नियंत्रण दोनों का उपयोग किया जाना चाहिए। जब ऐसी इष्टतम स्थिति पाई जाती है, तो प्रत्येक प्लेट की वास्तविक स्क्रीनिंग में नियंत्रणों को शामिल करना अनावश्यक हो जाता है। इसका कारण यह है कि स्क्रीनिंग प्रक्रिया बहुत कम है और क्योंकि एक प्लेट में अधिकांश प्रोटीन (पी) पीपीजीपीपी से बाध्य नहीं होने की उम्मीद करते हैं। इसलिए, ये प्रोटीन बाध्यकारी अंशों(चित्र 3)की मात्रा निर्धारित करते समय नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।

डीसीएएलए स्क्रीनिंग के लिए प्यूर 32पी-लेबल वाले पीपीपीजीपीपी और पीपीजीपीपी का उत्पादन भी जरूरी है। उदाहरण के लिए, जीटीपी से पीपीपीजीपीपी तक रूपांतरण अनुपात भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, पीएच, मैग्नीशियम और एंजाइमों की सांद्रता और प्रतिक्रिया समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। इसलिए छोटे पैमाने पर प्रतिक्रियाओं को एक बड़े पैमाने पर प्रतिक्रिया स्थापित करने से पहले सबसे अच्छी स्थिति की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

कैप्चर यौगिक तकनीक जैसी अन्य तकनीकों की तुलना में DRaCALA में स्पष्ट रूप से कुछ फायदे और नुकसान हैं (अधिक चर्चा के लिए रोलोफ्स एट अल9 देखें) । सबसे पहले, DRaCALA 32पी-लेबल (पी) पीपीजीपीपी का उपयोग करता है, जो (पी) पीपीजीपीपी की रासायनिक संरचना को प्रभावित नहीं करता है, जिससे संभावित लक्ष्य प्रोटीन के साथ इसकी बातचीत को संरक्षित किया जाता है। दूसरा, एक बार 32पी-(पी) पीपीजीपीपी और सेल lysates तैयार हो जाते हैं, DRaCALA का उपयोग करके ई. कोलाई ORFeome पुस्तकालय की ~ 60 प्लेटों को स्क्रीन करने में केवल एक सप्ताह लगता है। दरअसल, छोटी प्रायोगिक प्रक्रिया (धारा 4) ने उन प्रोटीनों की पहचान की अनुमति दी जो (पी) पीपीजीपीपी (मठ, नडग)12,17कोनीचा दिखाते हैं, जिसे कैप्चर कंपाउंड तकनीक18से चूक गई।

हालांकि, DRaCALA के उपयोग के लिए एक ORFeome अभिव्यक्ति पुस्तकालय की आवश्यकता होती है, जो केवल सीमित संख्या में मॉडल जीवों के लिए उपलब्ध है। इसके अलावा, आत्मीयता शुद्धिकरण टैग, जो ORFeome पुस्तकालय में प्रोटीन शुद्धिकरण की सुविधा के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, कभी-कभी प्रोटीन की अभिव्यक्ति या उचित तह को प्रभावित करते हैं, कुछ झूठे नकारात्मक का उत्पादन करते हैं। एक नई ORFeome पुस्तकालय आदर्श के रूप में दृढ़ संकल्प की आवश्यकता होगी कि क्या प्रोटीन के बहुमत (>८०%) इस तरह के एक परीक्षण भी शोधकर्ताओं को कवरेज और DRaCALA स्क्रीनिंग परिणामों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है ।

इन सीमाओं के बावजूद, DRaCALA कई न्यूक्लियोटाइड माध्यमिक दूतों के उपन्यास लक्ष्य प्रोटीन को सफलतापूर्वक उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। सिद्धांत रूप में, DRaCALA का उपयोग किसी भी छोटे लिगामेंट का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है यदि इसे रेडियोधर्मी आइसोटोप या यहां तक कि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके लेबल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनएनएफ प्रोजेक्ट ग्रांट (NNF19OC0058331) द्वारा वाईईजेड को समर्थन दिया जाता है, और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी स्कालोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते (एनओडी 801199) के तहत एमएलएस को समर्थन दिया जाता है।

Equation 1

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P-α-GTP Perkinelmer BLU006X250UC
96 x pin tool V&P Scientific VP 404 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long
96-well V-bottom microtiter plate Sterilin MIC9004 Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar OXOID - Thermo Fisher LP0011 Agar no. 1
ASKA collection strain NBRP, SHIGEN, JAPAN Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase SIGMA E1014-25KU genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Dye Bio-Rad 5000006 Reagent Concentrate
DMSO SIGMA D8418 ≥99.9%
DNase 1 SIGMA DN25-1G
gel filtration10x300 column GE Healthcare 28990944 contains 20% ethanol as preservative
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1214 Glycerol 87% for analysis
Hypercassette Amersham RPN 11647 20 x 40 cm
Imidazole SIGMA 56750 puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP Storage Phosphor Screen FUJIFILM 28956474 BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) SIGMA I6758 Isopropyl β-D-thiogalactoside
Lysogeny Broth (LB) Invitrogen - Thermo Fisher 12795027 Miller's LB Broth Base
Lysozyme SIGMA L4949 from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98%
MgCl2 (Magnesium chloride) SIGMA 208337
MilliQ water ultrapure water
multichannel pipette Thermo Scientific 4661110 F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels
NaCl VWR Chemicals 27810 AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose Qiagen 30230
Nitrocellulose Blotting Membrane Amersham Protran 10600003 Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS OXOID - Thermo Fisher BR0014G Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets
PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) SIGMA 202444
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) SIGMA 93482 Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)
Phosphor-imager GE Healthcare 28955809 Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager
Pipette Tips, filtered Thermo Scientific 94410040 ClipTip 12.5 μl nonsterile
Poly-Prep Chromatography column Bio-Rad 7311550 polypropylene chromatography column
Protease inhibitor Mini Pierce A32955 Tablets, EDTA-free
screw cap tube Thermo Scientific 3488 Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile
SLS 96-deep Well plates Greiner 780285 MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural
spin column Millipore UFC500396 Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters
Thermomixer Eppendorf 5382000015 Thermomixer C
TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) Merck Millipore 105579 DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris SIGMA BP152 Tris Base for Molecular Biology
Tween 20 SIGMA P1379 viscous non-ionic detergent
β-mercaptoethanol SIGMA M3148 99% (GC/titration)

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 169 DRaCALA ORFeome ppGpp cyclic AMP सी-di-AMP सी-di-GMP
लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना
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Schicketanz, M. L., Długosz, P., Zhang, Y. E. Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA). J. Vis. Exp. (169), e62331, doi:10.3791/62331 (2021).

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