15 एन CPMG μs-एमएस Timescale पर प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए छूट फैलाव
Summary
यहां, समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 15एन विश्राम प्रसार प्रोफाइल के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है।
Abstract
प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता एंजाइमैतिक उत्प्रेरक, लिगांड बाइंडिंग, एलोस्टरी और सिग्नलिंग के नियमन में मौलिक भूमिकाएं निभाती हैं, जो महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं हैं। संरचना और गतिशीलता के बीच संतुलन जैविक कार्य को नियंत्रित करने के तरीके को समझना आधुनिक संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक नई सीमा है और इसने कई तकनीकी और पद्धतिगत विकास को प्रज्वलित किया है। इनमें से, सीपीएमजी विश्राम फैलाव समाधान एनएमआर विधियां संरचना, काइनेटिक्स और थर्मोडायनामिक्स की संरचना पर अद्वितीय, परमाणु-संकल्प जानकारी प्रदान करती हैं, जो माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली प्रोटीन अनुरूप संतुलन संतुलन की है। यहां, अध्ययन 15एन विश्राम प्रसार प्रयोग के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एक उदाहरण के रूप में, बैक्टीरिया एंजाइम I के सी-टर्मिनल डोमेन में μs-ms गतिशीलता के विश्लेषण के लिए पाइपलाइन दिखाया गया है।
Introduction
कैर-पुरसेल मेबूम-गिल (सीपीएमजी) विश्राम प्रसार (आरडी) प्रयोगों का उपयोग नियमित आधार पर किया जाता है ताकि समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी1,2,3,4,5द्वारा माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली अनुरूप संतुलन की विशेषता हो। अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, CPMG तकनीकों को आधुनिक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर लागू करना अपेक्षाकृत आसान है, विशेष नमूना तैयारी चरणों (यानी, क्रिस्टलीकरण, नमूना ठंड या संरेखण, और/या एक फ्लोरोसेंट या पैरामैग्नेटिक टैग के साथ सहसंयोजक संयुग्मण की आवश्यकता नहीं है), और विनिमय प्रक्रियाओं पर अनुरूप संतुलन संतुलन लौटने की एक व्यापक लक्षण प्रदान करते हैं। एक सामंती संतुलन पर रिपोर्ट करने के लिए एक CPMG प्रयोग के लिए, दो शर्तों को लागू करना होगा: (i) मनाया एनएमआर स्पिन अनुरूप विनिमय (माइक्रोस्टेट्स) के दौर से गुजर राज्यों में विभिन्न रासायनिक बदलाव के अधिकारी होना चाहिए और (ii) विनिमय ~50 μs से ~ 10 एमएस तक के समय पैमाने पर होना चाहिए । इन शर्तों के तहत, मनाया गया ट्रांसवर्स छूट दर 
() आंतरिक आर2 (आर2 μs-ms गतिशीलता के अभाव में मापा जाता 
है) और ट्रांसवर्स विश्राम (आरपूर्व)में विनिमय योगदान का योग है। आर2ऑब्स में आरपूर्व योगदान को पल्स सीक्वेंस के सीपीएमजी ब्लॉक का गठन करने वाली 180 डिग्री दालों के बीच की दूरी को कम करके उत्तरोत्तर शमन किया जा सकता है, और परिणामस्वरूप आरडी घटता को ब्लोच-मैककॉनेल सिद्धांत का उपयोग करके मॉडलिंग की जा सकती है ताकि माइक्रोस्टेट्स के बीच रासायनिक बदलाव अंतर प्राप्त किया जा सके, प्रत्येक माइक्रोस्टेट की आंशिक आबादी, और माइक्रोस्टेट्स(चित्रा 1)1,2,3के बीच विनिमय की दरें।
15 एन सीपीएमजी प्रयोगों के लिए साहित्य में कई अलग-अलग पल्ससीक्वेंस और एनालिसिस प्रोटोकॉल की सूचना मिली है। इसके साथ ही प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूने को तैयार करने, एनएमआर प्रयोगों की स्थापना और अधिग्रहण और एनएमआर डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम(चित्र 2)पेश किए जाएंगे। प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं में स्थानांतरित करने की सुविधा के लिए, पल्स प्रोग्राम, प्रसंस्करण और विश्लेषण स्क्रिप्ट, और एक उदाहरण डेटासेट पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं और (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं। प्रदान की गई पल्स अनुक्रम में ऑफसेट-निर्भर कलाकृतियों6 के दमन के लिए सीपीएमजी ब्लॉक में चार चरण चरण चक्र शामिल है और यह कई इंटरलीव्ड प्रयोगों के अधिग्रहण के लिए कोडित है। इन अंतरप्रावेदित प्रयोगों में एक समान विश्राम अवधि होती है , लेकिन विभिन्न सीपीएमजी क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए दालों को फिर से केंद्रित करने की विभिन्नसंख्याएं 7. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वर्णित पल्स प्रोग्राम एनएमआर सिग्नल 8 के ट्रोसी घटक के 15एन आर2 कोमापताहै। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल को मध्यम और बड़े आकार केप्रोटीन4,5,9,10में अनुरूप विनिमय के लक्षण वर्णन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। छोटी प्रणालियों (<20 केडीए) के लिए, हेट्रोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम जुटना (एचएसक्यूसी) आधारित पल्स सीक्वेंस11,12 का उपयोग उचित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि प्रोटीन पर 15एन आरडी डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूना तैयार करने, एनएमआर डेटा की माप और आरडी प्रोफाइल के वि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईजीएमएस R35GM133488 से और रॉय जे कार्वर चैरिटेबल ट्रस्ट से वीवी तक के फंडों ने समर्थन दिया ।
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
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