Summary

15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

Published: April 19, 2021
doi:

Summary

Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.

Abstract

A dinâmica conformacional proteica desempenha papéis fundamentais na regulação da catálise enzimática, ligação de ligantes, aosteria e sinalização, que são importantes processos biológicos. Entender como o equilíbrio entre estrutura e dinâmica rege a função biológica é uma nova fronteira na biologia estrutural moderna e tem inflamado diversos desenvolvimentos técnicos e metodológicos. Entre estes, os métodos NMR da solução de relaxamento cpmg fornecem informações únicas de resolução atômica sobre a estrutura, cinética e termodinâmica do equilíbrio conformacional proteico que ocorre na escala de tempo μs-ms. Aqui, o estudo apresenta protocolos detalhados para aquisição e análise de um experimento de dispersão de relaxamento de 15N. Como exemplo, o pipeline para a análise da dinâmica μs-ms no domínio terminal C da bactéria Enzima I é mostrado.

Introduction

Os experimentos de dispersão de relaxamento (RD) Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) são usados em uma base de rotina para caracterizar o equilíbrio conformacional que ocorre na escala de tempo μs-ms por solução espectroscopia NMR1,2,3,4,5. Em comparação com outros métodos de investigação da dinâmica conformacional, as técnicas de CPMG são relativamente fáceis de implementar em espectrômetros de RN modernos, não exigem etapas especializadas de preparação de amostras (ou seja, cristalização, congelamento ou alinhamento de amostras e/ou conjugação codinâmica com uma etiqueta fluorescente ou paramagnética), e fornecem uma caracterização abrangente do equilíbrio conformacional retornando informações estruturais, cinéticas e termodinâmicas em processos de troca. Para que um experimento cpmg informe sobre um equilíbrio conformacional, duas condições devem ser aplicadas: (i) as rodadas de RMN observadas devem possuir diferentes mudanças químicas nos estados submetidos à troca conformacional (microestados) e (ii) a troca deve ocorrer em uma escala de tempo que varia de ~50 μs a ~10 ms. Nessas condições, a taxa de relaxamento transversal observada Equation 1 é a soma do R2 intrínseco (o R2 medido na ausência de dinâmica μs-ms) Equation 2 e a contribuição cambial para o relaxamento transversal (Rex). A contribuiçãoR ex para R2obs pode ser progressivamente saciada reduzindo o espaçamento entre os pulsos de 180° que constituem o bloco CPMG da sequência de pulso, e as curvas RD resultantes podem ser modeladas usando a teoria Bloch-McConnell para obter a diferença de mudança química entre os microestados, a população fracionária de cada microestado, e as taxas de troca entre microestados (Figura 1)1,2,3.

Várias sequências de pulso diferentes e protocolos de análise foram relatados na literatura para experimentos de 15N CPMG. Aqui, o protocolo implementado no laboratório é descrito. Em particular, serão introduzidas as etapas cruciais para a elaboração da amostra de RMN, a configuração e aquisição dos experimentos de RMN e o processamento e análise dos dados da RMN(Figura 2). Para facilitar a transferência do protocolo para outros laboratórios, o programa de pulso, scripts de processamento e análise e um exemplo de conjunto de dados são fornecidos como Arquivos Suplementares e estão disponíveis para download em (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). A sequência de pulso fornecida incorpora um ciclo de fase de quatro etapas no bloco CPMG para supressão de artefatos dependentes de deslocamento6 e é codificada para aquisição de vários experimentos intercalados. Esses experimentos intercalados têm um período de relaxamento idêntico, mas números diferentes de pulsos de refoco, a fim de alcançar diferentes campos CPMG7. Também é importante notar que o programa de pulso descrito mede o 15N R2 do componente TROSY do sinal NMR8. No geral, o protocolo foi aplicado com sucesso para a caracterização da troca conformacional em proteínas de médio e grande porte4,5,9,10. Para sistemas menores (<20 kDa), o uso de uma sequência de pulso baseada em Coerência Quântica Única Heteronuclear (HSQC)é aconselhável.

Protocol

1. Preparação da amostra de RMN Expresse e purifique uma amostra de 2H,15N-labled da proteína de interesse.NOTA: Enquanto uma amostra de proteína de 15N pode ser usada para aquisição do experimento CPMG RD, a perdateração (quando possível) aumenta drasticamente a qualidade dos dados obtidos. Protocolos para a produção de proteínas perdidos estão disponíveis na literatura13. Tampão troque a amostra de proteína purificada em um…

Representative Results

O protocolo descrito aqui resulta na aquisição de perfis RD para cada pico no espectro 1H-15N TROSY(Figura 3A). A partir dos perfis de RD adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de 15N de cada grupo backbone amide(Figura 3A,3B). Ao traçar oR ex na estrutura 3D da proteína sob investigação, é possível identificar as regiões estruturais submetidas…

Discussion

Este manuscrito descreve o protocolo implementado em laboratório para aquisição e análise de dados de 15N RD sobre proteínas. Em particular, são abordadas as etapas cruciais para a preparação da amostra de RMN, medição dos dados de RMN e análise dos perfis rd. Abaixo alguns aspectos importantes sobre a aquisição e análise de experimentos de RD são discutidos. No entanto, para uma descrição mais aprofundada do experimento e análise de dados, o estudo cuidadoso da literatura original é altamen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos da NIGMS R35GM133488 e do Roy J. Carver Charitable Trust para V.V.

Materials

Cryoprobe Bruker 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe Improve sensitivity
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 756822-1 >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge United Scientific supply CENTFG1 Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer Bruker Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 acquisition of the NMR data
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette Corning Incorporation 7095D-NMR Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube Willmad Precision 535-PP-7 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe Institute of Biosciences and Biotechnology research https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html NMR data processing
SPARKY University of California, San Francisco https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer) Bruker https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html acquisition software

References

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Cite This Article
Singh, A., Purslow, J. A., Venditti, V. 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the µs-ms Timescale. J. Vis. Exp. (170), e62395, doi:10.3791/62395 (2021).

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