15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散
Summary
ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを 取得および分析するための実験室で実施されるプロトコルの詳細な説明が提供される。
Abstract
タンパク質立体構造ダイナミクスは、重要な生物学的プロセスである酵素触媒、リガンド結合、アロステリー、およびシグナル伝達の調節において基本的な役割を果たします。構造とダイナミクスのバランスが生物学的機能をどのように支配するかを理解することは、現代の構造生物学における新たなフロンティアであり、いくつかの技術的および方法論的発展に火をつけた。これらの中で、CPMG緩和分散液NMR法は、μs-msタイムスケールで発生するタンパク質の構造、運動学、熱力学に関するユニークな原子分解能情報を提供します。ここでは、15Nの緩和分散実験の取得および分析のための詳細なプロトコルを提示する。例として、細菌のC末端領域におけるμs-msダイナミクスの分析のためのパイプラインを示す酵素I。
Introduction
カーパーセルメイブーム-ギル(CPMG)の緩和分散体(RD)実験は、溶液NMR分光法1、2、3、4、5によってμs-msタイムスケールで発生する立体構造平衡を特徴付けるためにルーチンベースで使用される。コンフォメーションダイナミクスの他の方法と比較して、CPMG技術は、現代のNMR分光計で比較的容易に実装でき、特殊なサンプル調製ステップ(すなわち、結晶化、サンプル凍結または位置合わせ、および/または蛍光または常磁性タグを有する共有結合結合)を必要とせず、構造、運動、熱力学の構造、運動、熱力学の情報を返す共統構造の包括的な特性を提供する。CPMG実験が立体構造平衡を報告するためには、(i)観測されたNMRスピンが、立体構造交換を行っている状態(微小状態)と(ii)の間に50μsから~10msの範囲の時間スケールで起こらなければならないという2つの条件が適用されなければならない。これらの条件下では、観察された横方向緩和率 
()は、組み込みR2(μs-msダイナミクスの無しで測定したR2) 
と、横弛緩(Rex)への交換寄与の和である。R2obsへのRex寄与は、パルス系列のCPMGブロックを構成する180°パルス間の間隔を減少させることによって徐々に消光することができ、そして得られたRD曲線は、ブロッホ・マッコネル理論を用いて、微小状態間の化学シフト差、各微小状態の小数体の母集団、およびマイクロステート間の交換率を得ることができる( 図1,2.
15N CPMG実験の文献では、いくつかの異なるパルスシーケンスおよび分析プロトコルが報告されている。本明細書において、実験室で実施されるプロトコルについて説明する。特に、NMRサンプルの調製、NMR実験の設定と取得、およびNMRデータの処理と分析のための重要なステップが導入される(図2)。プロトコルを他の研究所に転送しやすくするために、パルスプログラム、処理および解析スクリプト、およびデータセットの例が補足ファイルとして提供され、(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)からダウンロードできます。提供されたパルスシーケンスは、オフセット依存性アーチファクト6の抑制のためにCPMGブロックに4段階のフェーズサイクルを組み込み、いくつかのインターリーブ実験を取得するためにコード化される。これらのインターリーブ実験は、同じ緩和期間を有するが、異なるCPMGフィールド7を達成するために、再焦点パルスの異なる数を有する。また、説明されたパルスプログラムがNMR信号8のTROSY成分の15 NR2を測定することに注意することも重要である。全体として、このプロトコルは、中型および大型タンパク質4、5、9、10における立体構造交換の特性評価に対して正常に適用されている。より小さいシステム(<20 kDa)の場合、ヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)ベースのパルスシーケンス11、12の使用が推奨される。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、タンパク質に関する15N RDデータの取得および分析のために研究室で実施されるプロトコルについて説明します。特に、NMRサンプルの調製、NMRデータの測定、およびRDプロファイルの分析のための重要なステップがカバーされています。RD実験の取得と解析に関する重要な側面について以下に説明します。しかし、実験とデータ分析の詳細な説明のために、元の文献の慎重な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIGMS R35GM133488からの資金とロイJ.カーバー慈善信託からV.V.への資金によって支えられました。
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
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