Qui viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di profili di dispersione di rilassamento 15N mediante spettroscopia NMR soluzione.
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Articolo metodologico
15 di cui: la commissione per i N CPMG Relaxation Dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le dinamiche conformazionali proteiche svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della catalisi enzimatica, del legame del ligando, della legasteria e della segnalazione, che sono importanti processi biologici. Comprendere come l'equilibrio tra struttura e dinamica governa la funzione biologica è una nuova frontiera nella moderna biologia strutturale e ha acceso diversi sviluppi tecnici e metodologici. Tra questi, i metodi NMR della soluzione di dispersione di rilassamento CPMG forniscono informazioni uniche a risoluzione atomica sulla struttura, la cinetica e la termodinamica degli equilibri conformazionali proteici che si verificano sulla scala cronologica μs-ms. Qui, lo studio presenta protocolli dettagliati per l'acquisizione e l'analisi di un esperimento di dispersione di rilassamento 15N. Ad esempio, viene mostrata la pipeline per l'analisi della dinamica μs-ms nel dominio C-terminale dei batteri Enzima I.
Introduzione
Gli esperimenti di dispersione di rilassamento Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) (RD) vengono utilizzati su una base di routine per caratterizzare gli equilibri conformazionali che si verificano sulla scala cronologica μs-ms mediante spettroscopia NMRsoluzione 1,2,3,4,5. Rispetto ad altri metodi per lo studio della dinamica conformazionale, le tecniche CPMG sono relativamente facili da implementare sui moderni spettrometri NMR, non richiedono fasi specializzate di prepa....
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Protocollo
1. Preparazione del campione NMR
- Esprimere e purificare un campione di 2H,15N-labled della proteina di interesse.
NOTA: Mentre un campione diproteine con etichetta N può essere utilizzato per l'acquisizione dell'esperimento CPMG RD, la perditauterazione (ove possibile) aumenta notevolmente la qualità dei dati ottenuti. I protocolli per la produzione di proteine peruteuterate sono disponibili nella letteratura13. - Tamponare lo scambio del campione proteico purificato in un buffer NMR degassato.
- Trasferire il campione NMR nel tubo NMR.
NOTA: La concentrazione del campione NMR dev....
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Risultati
Il protocollo qui descritto si traduce nell'acquisizione di profili RD per ogni picco nello spettro 1H-15N TROSY (Figura 3A). Dai profili RD acquisiti è possibile stimare il contributo di scambio al rilassamento trasversale di 15N di ciascun gruppo dorsale di ammide(Figura 3A,3B). Tracciandol'ex R sulla struttura 3D della proteina in esame, è possibile identificare le regioni strutturali sottoposte a s.......
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Discussione
Questo manoscritto descrive il protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di 15dati N RD sulle proteine. In particolare, sono trattate le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, la misurazione dei dati NMR e l'analisi dei profili rd. Di seguito vengono discussi alcuni aspetti importanti riguardanti l'acquisizione e l'analisi degli esperimenti di ricerca e sviluppo. Tuttavia, per una descrizione più approfondita dell'esperimento e dell'analisi dei dati, è altamente raccoma.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. Non dichiariamo conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da fondi di NIGMS R35GM133488 e dal Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Criosonda | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D criosonda | Migliora la sensibilità |
| Ossido di deuterio | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8% puro, utilizzato nella preparazione di campioni NMR e colture deuterate |
| Centrifuga manuale | United Scientific | fornisce CENTFG1 | Utilizzato per rimuovere eventuali bolle d'aria o liquidi residui bloccati sulle pareti del tubo NMR. |
| Spettrometro NMR ad alto campo | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisizione dei dati NMR |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modellazione dei dati NMR |
| Pasteur NMR Pipetta | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pipetta per pastore in vetro Pyrex per trasferire il campione liquido in tubo NMR |
| Precisione Willmad | 535-PP-7 | parete sottile 7'' tubo cilindrico di vetro | |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR elaborazione dati NMR |
| SPARKY | Università della California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analisi dei dati NMR |
| Tospin 3.2 (o più recente) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Software di acquisizione |
Riferimenti
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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Ristampe e permessi
