Qui viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo implementato in laboratorio per l’acquisizione e l’analisi di profili di dispersione di rilassamento 15N mediante spettroscopia NMR soluzione.
Le dinamiche conformazionali proteiche svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della catalisi enzimatica, del legame del ligando, della legasteria e della segnalazione, che sono importanti processi biologici. Comprendere come l’equilibrio tra struttura e dinamica governa la funzione biologica è una nuova frontiera nella moderna biologia strutturale e ha acceso diversi sviluppi tecnici e metodologici. Tra questi, i metodi NMR della soluzione di dispersione di rilassamento CPMG forniscono informazioni uniche a risoluzione atomica sulla struttura, la cinetica e la termodinamica degli equilibri conformazionali proteici che si verificano sulla scala cronologica μs-ms. Qui, lo studio presenta protocolli dettagliati per l’acquisizione e l’analisi di un esperimento di dispersione di rilassamento 15N. Ad esempio, viene mostrata la pipeline per l’analisi della dinamica μs-ms nel dominio C-terminale dei batteri Enzima I.
Gli esperimenti di dispersione di rilassamento Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) (RD) vengono utilizzati su una base di routine per caratterizzare gli equilibri conformazionali che si verificano sulla scala cronologica μs-ms mediante spettroscopia NMRsoluzione 1,2,3,4,5. Rispetto ad altri metodi per lo studio della dinamica conformazionale, le tecniche CPMG sono relativamente facili da implementare sui moderni spettrometri NMR, non richiedono fasi specializzate di preparazione del campione (cioè cristallizzazione, congelamento o allineamento del campione e / o coniugazione covalente con un tag fluorescente o paramagnetico) e forniscono una caratterizzazione completa degli equilibri conformazionali che ritornano informazioni strutturali, cinetiche e termodinamiche sui processi di scambio. Affinché un esperimento CPMG riferisci su un equilibrio conformazionale, devono essere applicate due condizioni: (i) gli spin NMR osservati devono possedere diversi cambiamenti chimici negli stati sottoposti a scambio conformazionale (microstati) e (ii) lo scambio deve avvenire ad una scala di tempo che va da ~ 50 μs a ~ 10 ms. In queste condizioni, il tasso di rilassamento trasversale osservato è la somma dell’intrinseco R2 (l’R2 misurato in assenza di dinamica μs-ms) e il
contributo di scambio al rilassamento trasversale (Rex). Il contributo Rex a R2obs può essere progressivamente spento riducendo la spaziatura tra gli impulsi di 180° che costituiscono il blocco CPMG della sequenza di impulsi, e le curve RD risultanti possono essere modellate usando la teoria di Bloch-McConnell per ottenere la differenza di spostamento chimico tra i microstati, la popolazione frazionata di ogni microstato e i tassi di scambio tra microstati(Figura 1)1,2,3.
Diverse sequenze di impulsi e protocolli di analisi sono stati riportati in letteratura per esperimenti CPMG 15N. Qui viene descritto il protocollo implementato in laboratorio. In particolare, saranno introdotte le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, l’installazione e l’acquisizione degli esperimenti NMR e l’elaborazione e l’analisi dei dati NMR(figura 2). Per facilitare il trasferimento del protocollo ad altri laboratori, il programma pulse, gli script di elaborazione e analisi e un set di dati di esempio sono forniti come file supplementari e sono disponibili per il download all’https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. La sequenza di impulsi fornita incorpora un ciclo di fase in quattro fasi nel blocco CPMG per la soppressione degli artefatti dipendenti dall’offset6 ed è codificata per l’acquisizione di diversi esperimenti interfogliati. Questi esperimenti interfogliati hanno un periodo di rilassamento identico ma un numero diverso di impulsi di rifocalizzazione al fine di ottenere diversi campi CPMG7. È anche importante notare che il programma di impulsi descritto misura il 15N R2 della componente TROSY del segnale NMR8. Nel complesso, il protocollo è stato applicato con successo per la caratterizzazione dello scambio conformazionale in proteine di medie e grandidimensioni 4,5,9,10. Per i sistemi più piccoli (<20 kDa), è consigliabile l'uso di una sequenza di impulsi basata sulla coerenza quantistica singola (HSQC) eteronucleare (HSQC)11,12.
Questo manoscritto descrive il protocollo implementato in laboratorio per l’acquisizione e l’analisi di 15dati N RD sulle proteine. In particolare, sono trattate le fasi cruciali per la preparazione del campione NMR, la misurazione dei dati NMR e l’analisi dei profili rd. Di seguito vengono discussi alcuni aspetti importanti riguardanti l’acquisizione e l’analisi degli esperimenti di ricerca e sviluppo. Tuttavia, per una descrizione più approfondita dell’esperimento e dell’analisi dei dati, è altamente racco…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da fondi di NIGMS R35GM133488 e dal Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.
Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |