Summary
La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.
Abstract
La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale della proteina (PTM) coinvolta nella regolazione di diverse vie cellulari, tra cui l'elaborazione dell'RNA, la trasduzione del segnale, la risposta al danno del DNA, la biogenesi dei miRNA e la traduzione.
Negli ultimi anni, grazie agli sviluppi biochimici e analitici, la proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS) è emersa come la strategia più efficace per caratterizzare il metil-proteoma cellulare con risoluzione a sito singolo. Tuttavia, l'identificazione e la profilazione della R-metilazione della proteina in vivo da parte della SM rimane impegnativa e soggetta a errori, principalmente a causa della natura substechiometrica di questa modifica e della presenza di varie sostituzioni aminoacidiche e metil-esterificazione chimica di residui acidi che sono isobarici alla metilazione. Pertanto, sono necessari metodi di arricchimento per migliorare l'identificazione di R-metil-peptidi e strategie di convalida ortogonale per ridurre i tassi di falsa scoperta (FDR) negli studi di metil-proteomica.
Qui viene descritto un protocollo specificamente progettato per l'identificazione e la quantificazione di R-metil-peptidi ad alta affidabilità da campioni cellulari, che accoppia la marcatura metabolica delle cellule con la metionina codificata da isotopi pesanti (hmSILAC) e la digestione in soluzione a doppia proteasi dell'estratto di cellule intere, seguita dal frazionamento cromatografico off-line ad alto pH a fase invertita (HpH-RP) e dall'arricchimento di affinità di R-metil-peptidi utilizzando anticorpi anti-pan-R-metile. Dopo l'analisi MS ad alta risoluzione, i dati grezzi vengono prima elaborati con il pacchetto software MaxQuant e i risultati vengono quindi analizzati da hmSEEKER, un software progettato per la ricerca approfondita di coppie di picco MS corrispondenti a peptidi metilici leggeri e pesanti all'interno dei file di output MaxQuant.
Introduction
L'arginina (R)-metilazione è una modificazione post-traduzionale (PTM) che decora circa l'1% del proteoma 1 deimammiferi. Le proteine arginina metiltransferasi (PRMT) sono gli enzimi che catalizzano la reazione di R-metilazione mediante la deposizione di uno o due gruppi metilici agli atomi di azoto (N) del gruppo guanidino della catena laterale di R in modo simmetrico o asimmetrico. Nei mammiferi, i PRMT possono essere raggruppati in tre classi - tipo I, tipo II e tipo III - a seconda della loro capacità di depositare sia la monometilazione (MMA) che la dimetilazione asimmetrica (ADMA), l'MMA e la dimetilazione simmetrica (SDMA) o solo MMA, rispettivamente 2,3. I PRMT colpiscono principalmente i residui di R situati all'interno di regioni ricche di glicina e arginina, noti come motivi GAR, ma alcuni PRMT, come PRMT5 e CARM1, possono metilare motivi ricchi di prolina-glicina-metionina (PGM)4. La R-metilazione è emersa come modulatore proteico di diversi processi biologici, come lo splicing dell'RNA5, la riparazione del DNA6, la biogenesi7 dei miRNA e la traduzione2, promuovendo la ricerca su questo PTM.
La spettrometria di massa (MS) è riconosciuta come la tecnologia più efficace per studiare sistematicamente la R-metilazione globale a risoluzione di proteine, peptidi e siti. Tuttavia, questo PTM richiede alcune precauzioni particolari per la sua identificazione ad alta affidabilità da parte della SM. In primo luogo, la R-metilazione è substechiometrica, con la forma non modificata dei peptidi che è molto più abbondante di quelli modificati, in modo che gli spettrometri di massa che operano in modalità Data Dependent Acquisition (DDA) frammentano peptidi non modificati ad alta intensità più spesso delle loro controparti metilate a bassa intensità8. Inoltre, la maggior parte dei flussi di lavoro basati su MS per l'identificazione del sito R-metilato soffrono di limitazioni a livello di analisi bioinformatica. In effetti, l'identificazione computazionale dei peptidi metilici è soggetta ad alti tassi di falsa scoperta (FDR), perché questo PTM è isobarico a varie sostituzioni aminoacidiche (ad esempio, glicina in alanina) e modificazioni chimiche, come la metil-esterificazione dell'aspartato e del glutammato9. Pertanto, metodi basati sulla marcatura isotopica di gruppi metilici, come l'Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), sono stati implementati come strategie ortogonali per l'identificazione sicura della MS di metilazioni in vivo , riducendo significativamente il tasso di annotazioni false positive10.
Recentemente, sono stati ottimizzati vari protocolli a livello di proteoma per studiare le proteine R-metilate. Lo sviluppo di strategie basate su anticorpi per l'arricchimento di immuno-affinità di R-metil-peptidi ha portato all'annotazione di diverse centinaia di siti R-metilati in cellule umane11,12. Inoltre, molti studi 3,13 hanno riportato che l'accoppiamento dell'arricchimento basato su anticorpi con tecniche di separazione peptidica come il frazionamento cromatografico HpH-RP può aumentare il numero complessivo di peptidi metilici identificati.
Questo articolo descrive una strategia sperimentale progettata per l'identificazione sistematica e ad alta affidabilità di siti R-metilati in cellule umane, basata su varie fasi biochimiche e analitiche: estrazione di proteine da cellule marcate con hmSILAC, digestione enzimatica doppia parallela con proteasi Tripsina e LysargiNase, seguita da frazionamento cromatografico HpH-RP di peptidi digeriti, accoppiato con arricchimento di immuno-affinità basato su anticorpi di MMA-, SDMA-, e peptidi contenenti ADMA. Tutti i peptidi arricchiti di affinità vengono quindi analizzati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (LC)-MS/MS in modalità DDA e i dati grezzi MS vengono elaborati dall'algoritmo MaxQuant per l'identificazione dei peptidi R-metilici. Infine, i risultati dell'output di MaxQuant vengono elaborati con hmSEEKER, uno strumento bioinformatico sviluppato internamente per cercare coppie di peptidi metilici pesanti e leggeri. In breve, hmSEEKER legge e filtra le identificazioni dei peptidi metilici dal file msms, quindi abbina ciascun peptide metilico al suo picco MS1 corrispondente nel file allPeptides e, infine, cerca il picco della controparte peptidica pesante / leggera. Per ogni coppia putativa pesante-leggera, vengono calcolati i parametri Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) e i doppietti che si trovano all'interno di cut-off definiti dall'utente vengono etichettati come veri positivi. Il flusso di lavoro del protocollo biochimico è descritto nella Figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coltura cellulare ed estrazione delle proteine (tempo: 3 - 4 settimane richieste)
- Coltivare cellule HeLa in parallelo in mezzi forniti rispettivamente con metionina leggera (L) o pesante (H) (vedere Tabella 1 per la composizione del mezzo). Su almeno otto divisioni cellulari, raccogliere un'aliquota di cellule da ciascun canale SILAC ed eseguire il test di incorporazione.
NOTA: Per verificare l'efficienza di incorporazione, testare mediante analisi LC-MS/MS che la percentuale di metionina pesante (Met-4) nel canale pesante sia il più vicino possibile al 100%. Analizzare un'aliquota di celle marcate pesantemente mediante LC-MS/MS (per le impostazioni vedere Tabella 2), quindi elaborare i dati MS con MaxQuant utilizzando i parametri indicati nella Tabella 3. Per verificare l'incorporazione di Met-4 è disponibile uno script sviluppato internamente su https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. - Considerare l'incorporazione di metionina pesante come completa quando raggiunge >97%. Quando ogni canale raggiunge un numero totale di circa 60 x 106 cellule (corrispondenti a circa 40 piatti di 15 cm ciascuno all'85% di confluenza per le cellule HeLa, con variazioni a seconda del tipo di cellula) li raccolgono. Contarli attentamente, mescolare in proporzione 1:1 e pellettare per centrifugazione a 335 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: Per valutare la corretta miscelazione 1:1 L/H, tenere un'aliquota e farla scorrere su una fetta di un gel che è noto per contenere un'elevata abbondanza e proteine fortemente R-metilate (ad esempio, fibrillarina). Se l'etichettatura ha avuto successo ed è stata raggiunta una miscelazione 1:1, dovrebbe esserci un rapporto 1:1 di versioni leggere e pesanti dei peptidi R-metilati presenti nel campione. In alternativa, tenere un'aliquota del campione misto da analizzare con LC-MS/MS, quindi elaborare i dati MS con MaxQuant utilizzando i parametri indicati nella Tabella 3 e tracciare la distribuzione del rapporto H/L Log2 come illustrato nella Figura 2C. Il protocollo può essere fermato qui congelando a scatto il pellet e conservandolo a -80 °C. - Risospendere il pellet cellulare in quattro volumi di tampone di lisi (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone di lisi) rispetto al volume del pellet cellulare. Ad esempio, utilizzare 6 ml di tampone di lisi per un pellet da 120 x 10 6 celle Hela (60 x 10 6 Light + 60 x 106 Heavy) corrispondenti a 1,5 mL di volume.
NOTA: L'estrazione delle proteine deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) perché Lysis Buffer contiene l'agente caotropico 9 M Urea che precipita a temperatura del ghiaccio; pertanto, l'aggiunta di un ampio spettro di inibitori della proteasi della serina e della cisteina è importante, così come l'inibitore delle fosfatasi, per proteggere simultaneamente le proteine dalla degradazione proteolitica e dalla defosforilazione, cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi sono disponibili in commercio come piccole compresse, vedere Tabella 1 e Tabella dei materiali. - Sonicare il campione con un sonicatore distruttore di cellule microtip per almeno cinque cicli di 15 s ON e 30 s OFF, per garantire un'efficiente rottura delle membrane cellulari e il rilascio e il taglio del DNA. Controllare la viscosità dell'estratto pipettando la soluzione su e giù. Se è troppo viscoso a causa del taglio incompleto del DNA e della solubilizzazione della membrana, ripetere i cicli di sonicazione.
NOTA: Assicurarsi che il campione non si surriscaldi durante la sonicazione, perché le alte temperature possono danneggiare le proteine. Tuttavia, non è possibile mettere il campione su ghiaccio tra i cicli di sonicazione, a causa della presenza di 9M Urea; quindi, è consigliabile mettere in pausa per 60 s OFF tra diversi cicli di sonicazione. Inoltre, evitare la formazione di bolle d'aria durante la sonicazione perché riducono l'efficacia della sonicazione. - Centrifugare l'estratto a 3.000 x g per 10 minuti a RT per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 ml.
- Misurare il contenuto proteico dell'estratto con un test colorimetrico, come Bradford o acido bicinconinico (BCA)14,15. Una quantità iniziale ottimale di estratto proteico per questo protocollo è compresa tra 20-30 mg.
NOTA: I tamponi di lisi contenenti urea ad alta concentrazione sono compatibili sia con il test di quantificazione Bradford che BCA; altri tipi di tampone di lisi, come quelli che includono un'alta concentrazione di sodio dodecilsolfato (SDS), non sono compatibili con Bradford.
2.Digestione del lisato (tempo indicativo richiesto 2 ore)
- Eseguire la riduzione del gruppo tiolo (-SH) delle proteine utilizzando una soluzione madre di ditiotreitolo (DTT) disciolta in acqua ultrapura ad una concentrazione finale di 4,5 mM e lasciare andare la reazione per 30 minuti a 55 °C.
NOTA: È possibile preparare una soluzione DTT madre da 1 M e conservarla a -20 °C per un massimo di 1 mese, scongelando solo le aliquote necessarie per ogni esperimento. In alternativa, la tris-(2-carbossietil)-fosfina (TCEP) riducente del sulfidrile (TCEP) può essere utilizzata per eseguire la riduzione dei gruppi -SH; soprattutto per la conservazione a lungo termine delle proteine, la TCEP è significativamente più stabile della DTT senza chelati metallici come EGTA nel tampone, mentre la DTT è più stabile se sono presenti chelati metallici16. - Eseguire l'alchilazione del gruppo tiolo (-SH) delle proteine aggiungendo iodoacetamide (IAA) ad una concentrazione di 10 mM e incubare per 15 minuti a RT al buio. Eseguire l'incubazione delle proteine estratte con la soluzione di IAA al buio perché l'IAA è fotosensibile.
NOTA: La soluzione madre IAA a 100 mM deve essere preparata fresca prima di ogni esperimento. In alternativa, la cloroacetammide potrebbe essere utilizzata per eseguire l'alchilazione dei gruppi -SH, specialmente se l'obiettivo dell'esperimento è quello di analizzare il cross-talk tra metilazione e ubiquitinazione perché l'artefatto indotto da IAA imita l'ubiquitinazione17. - Prima di procedere con la fase di digestione delle proteine, conservare un'aliquota di estratto proteico (1/1.000 di lisato non digerito iniziale) per la successiva analisi su gel colorato con coomassie SDS-PAGE e il confronto con una quantità corrispondente di campione durante la digestione; Questo test serve a verificare l'efficienza della proteolisi (vedi punto 4).
- Diluire l'estratto proteico rimanente con quattro volumi di 20 mM HEPES pH 8,0, per raggiungere una concentrazione finale di urea di 2 M (che è la concentrazione compatibile con l'attività enzimatica delle proteasi). Dividere il campione in due parti: nella prima aggiungere Tripsina modificata di grado sequenziale e nella seconda aggiungere la proteasi LysargiNase (vedi Tabella dei materiali) in proporzione 1:100 (p/p) rispetto ai mg del materiale di partenza. Lasciare per una notte a 37 °C in termomiscelatore a 600 giri/min, per consentire la digestione enzimatica.
NOTA: La tripsina, l'enzima di digestione più comune in proteomica, si scinde al C-terminale di R e lisina (K), generando peptidi con una distribuzione di carica che si traduce in spettri di frammentazione dominati da ioni di tipo y dopo dissociazione indotta da collisione (CID). LysargiNase si scinde al N-terminale di R e K, rispecchiando quindi la specificità della scissione della tripsina e generando peptidi che rilasciano principalmente ioni di tipo b dopo la frammentazione del CID. Questa analisi combinata porta ad una maggiore copertura della sequenza peptidica e ad una maggiore fiducia nell'identificazione sito-specifica delle R-metilazioni18.
3. Purificazione dei peptidi (tempo indicativo richiesto 1 ora)
- Conservare un'aliquota di peptidi digeriti da entrambe le reazioni, raccogliendo gli stessi volumi di cui al punto 2.3 per il confronto su SDS-PAGE Gel colorato con Coomassie per valutare l'efficienza della digestione della proteasi (vedi punto 4).
- Arrestare la digestione acidificando i campioni con l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) ad una concentrazione finale del 5%. Mescolare bene e misurare il pH dei campioni con una cartina tornasole (il pH dovrebbe essere intorno a 3). Vortice brevemente e ruotare i campioni acidificati prima di trasferirli in nuove provette da 15 ml.
- Pulire i campioni attraverso due cartucce C18 vac (peso assorbente 1 g, vedere Tabella dei materiali), una per il campione digerito con Trypsin e l'altra per il campione digerito con LysargiNase. Preparare il solvente A, il solvente B e il tampone di lavaggio (vedere la Tabella 1 per la composizione del tampone).
- Utilizzando pipette di vetro, reidratare ogni cartuccia con 6 ml di ACN al 100% per 3 volte. Successivamente, equilibrare ogni cartuccia in sequenza con 3-9-18 ml di solvente A. Caricare i campioni (le resine dovrebbero diventare gialle). Lavare nuovamente in sequenza con 3-9-18 ml di solvente A e quindi aggiungere 6 ml di tampone di lavaggio. Trasferire ciascuna colonna in provette pulite da 15 mL ed eluire i campioni con 7 mL di solvente B. Ripetere la fase di eluizione con 7 mL di solvente B, per un volume finale di 14 mL.
Nota : eseguire tutti questi passaggi lasciando che i buffer e la soluzione passino attraverso le colonne per gravità. Per favorire il flusso dei tamponi attraverso la colonna, spingere lentamente ogni soluzione con una siringa, per imitare il vuoto. - Risparmiare 50 μL di peptidi eluiti, 50 μL di flow-through (FT), 50 μL di lavaggio con solvente A e 50 μL dell'ultimo lavaggio per la successiva valutazione peptidica mediante SDS-PAGE (vedere punto 4).
4. Gel SDS-PAGE colorato con Coomassie (tempo indicativo richiesto 2 ore)
- Eseguire le aliquote raccolte su un gel SDS-PAGE al 17,5% e colorare con la colorazione Instant-Blu Coomassie (vedi Tabella dei materiali). Il risultato atteso è rappresentato nella Figura 2A.
5. Liofilizzazione peptidica (tempo indicativo 2 giorni)
- Coprire i tubi da 15 mL contenenti i peptidi eluiti con pellicola di paraffina, che viene poi perforata con un ago da 20 G per creare 3-5 fori. Mettere i tubi in ghiaccio secco per almeno 30 minuti, fino a quando i campioni sono completamente congelati.
- Liofilizzare le frazioni congelate per 48 h, un intervallo di tempo tipicamente sufficiente a garantire una liofilizzazione completa dei campioni, anche se può verificarsi una certa variabilità, dovuta alle prestazioni del liofilizzatore.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, conservando i campioni liofilizzati a -80 °C.
6. Frazionamento cromatografico HPH-RP off-line di peptidi (tempo indicativo 4 giorni)
- Per frazionare i peptidi in 60 frazioni, utilizzare la cromatografia liquida HpH-RP, utilizzando il sistema HPLC dotato di colonna HPLC C12-RP (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
- Prima dell'esecuzione, preparare nuovi buffer A e buffer B (la composizione dei buffer è descritta nella tabella 1).
- Filtrare tutte le soluzioni con un filtro da 0,22 μm e degasarle in un bagno sonicatore per almeno 30 minuti.
- Sciogliere i peptidi liofilizzati in 1 mL di tampone A. Filtrare i peptidi attraverso un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,45 μm, utilizzando una siringa.
- Impostare la velocità di frazionamento a 1 mL/min di flusso e raccogliere 1 mL di frazioni, utilizzando il seguente gradiente cromatografico: da 5% B a 30% B in 60 min; 30% B a 60% in 2 min; 70% B per 3 min.
- Impostare l'HPLC in modo che, a questo punto, la raccolta delle frazioni venga interrotta e la pendenza mantenuta al 70% del buffer B per 5 minuti prima di un lavaggio esteso della colonna con un gradiente rapido fino al 100% del buffer B, seguito da un lavaggio finale (buffer B al 100% per 10 minuti).
NOTA: Alla fine di ogni ciclo cromatografico, equilibrare sempre la colonna con il buffer A al 100% per 20 minuti. - Frazionare entrambi i campioni digeriti separatamente con tripsina e LysargiNase mediante gradienti cromatografici Off-Line HpH RP, come descritto al punto 6.5.
- Per ogni gradiente cromatografico, raccogliere tutte le frazioni in una piastra profonda da 96 pozzetti.
- Raggruppare le frazioni raccolte prima del gradiente in un'unica frazione denominata PRE. Concatenare le 60 frazioni del gradiente cromatografico liquido (LC) HpH-RP raggruppandole in modo non contiguo in 14 frazioni finali. Per ottenere tale concatenazione non contigua, raggruppare le frazioni HpH-RP secondo il seguente schema.
- Frazione 1 (volume finale 5 ml): Pool 1-15-29-43-57
- Frazione 2 (volume finale 5 ml): Pool 2-16-30-44-58
- Frazione 3 (volume finale 5 ml): Pool 3-17-31-45-59
- Frazione 4 (volume finale 5 ml): Pool 4-18-32-46-60
- Frazione 5 (volume finale 4 ml): Pool 5-19-33-47
- Frazione 6 (volume finale 4 ml): Pool 6-20-34-48
- Frazione 7 (volume finale 4 ml): Pool 7-21-35-49
- Frazione 8 (volume finale 4 ml): Pool 8-22-36-50
- Frazione 9 (volume finale 4 ml): Pool 9-23-37-51
- Frazione 10 (volume finale 4 ml): Pool 10-24-38-52
- Frazione 11 (volume finale 4 ml): Pool 11-25-39-53
- Frazione 12 (volume finale 4 ml): Pool 12-26-40-54
- Frazione 13 (volume finale 4 ml): Pool 13-27-41-55
- Frazione 14 (volume finale 4 ml): Pool 14-28-42-56
NOTA: La concatenazione non contigua consiste nel combinare frazioni a rilascio precoce, medio e tardivo, il che consente di aumentare l'eterogeneità nella composizione peptidica all'interno delle frazioni raggruppate. Di conseguenza, la miscela peptidica di ciascuna frazione aggregata viene efficacemente separata, con una co-eluizione limitata, nella successiva cromatografia a basso flusso nanometrico a basso PH-RP-LC direttamente accoppiata allo spettrometro di massa.
- Raggruppare le frazioni raccolte dopo il gradiente in una frazione univoca, denominata POST.
NOTA: Includendo le frazioni PRE e POST gradiente, si ottiene un totale di 16 frazioni, in provette da 15 mL (vedi Figura 3A). - Coprire i tubi da 15 mL con pellicola di paraffina e perforarli con un ago da 20 G per generare 3-5 fori. Congelarli incubando le provette da centrifuga in ghiaccio secco fino a quando ogni frazione è completamente congelata.
- Liofilizzare le frazioni per circa 48 h. Assicurarsi che ogni campione sia completamente asciutto prima di fermare il liofilizzatore.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, conservando i campioni liofilizzati a -80 °C.
7. Arricchimento di immuno-affinità peptidica R-metilata (tempo indicativo 2 giorni)
- Eseguire l'arricchimento sequenziale di immuno-affinità del peptide modificato con anticorpi anti-pan-R-metilazione in parallelo, ma separatamente per i due campioni dalle digestioni Tripsina e LysargiNase, rispettivamente. Il tampone di purificazione dell'immunoaffinità (IAP) è fornito dalla società che acquista gli anticorpi anti-pan-R-metile per l'arricchimento dell'affinità peptidica modificata (i dettagli sono in Tabella Materiale e Reagenti). Il tampone IAP è concentrato 10x e deve essere diluito 10 volte prima dell'uso.
NOTA: il buffer IAP 1x può essere conservato a temperature comprese tra -20 °C e un massimo di 1 anno. - Centrifugare i peptidi liofilizzati a 2.000 x g per 5 minuti a RT per far girare i peptidi sul fondo del tubo da 15 ml. Risospendere i peptidi liofilizzati con 250 μL di 1x tampone IAP per tubo da 15 mL e trasferirli in una provetta a basso legame da 1,5 ml. Controllare con una cartina tornasole se il pH è >6.
- Conservare una piccola aliquota (circa il 5% del volume) di ciascuna frazione come input per la successiva analisi della SM.
- Dividere ogni frazione in due aliquote, al fine di eseguire l'immuno-arricchimento di peptidi asimmetricamente dimetilati (ADMA) e simmetricamente di-metilati (SDMA) in parallelo.
- Utilizzare tre flaconcini degli anticorpi anti-pan-R-metilati selezionati coniugati a perle di agarosio di proteina A per 10 mg dell'estratto proteico iniziale.
- Preparare la giusta quantità di anticorpi coniugati alle perle di agarosio centrifugando ogni flaconcino a 2.000 x g per 30 s e rimuovendo il tampone dalle perle. Lavare le perle tre volte con 1 mL di 1x PBS sempre centrifugandole a 2.000 x g per 30 s.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 40 μL 1x PBS per ciascun flaconcino; raggrupparli e infine dividerli equamente in 16 frazioni (in modo che 2,5 μL di perline anticorpali vengano aggiunti a ciascuna frazione).
- Aggiungere 250 μL di 1x tampone IAP a ciascun tubo, mescolare capovolgendo e lasciarlo incubare su una ruota rotante per 2 ore a 4 °C.
NOTA: Mescolare i campioni invertendo i tubi da 1,5 mL anziché pipettandoli con micropunte, che potrebbero danneggiare le perline o causarne la perdita. - Dopo 2 ore di incubazione, centrifugare i tubi da 1,5 ml contenenti peptidi e perle coniugate con anticorpi pan-R metile a 2.000 x g per 30 s per pellettare le perle; trasferire l'FT da ciascuna frazione in tubi puliti da 1,5 mL a basso legame.
- Aggiungere le perle coniugate agli anticorpi contro la R-monometilazione (MMA) agli FT e ripetere i passaggi da 7,7 a 7,9.
- Durante l'incubazione dei campioni peptidici con le perle di MMA, lavare il doppio delle frazioni precedentemente immunoprecipitate con anti-ADMA e SDMA con 250 μL di tampone IAP (invertendo e non pipettando) e scartare il surnatante ad ogni lavaggio.
- Ripetere il lavaggio con LC-MS grado H2O tre volte.
- Eluire i peptidi R-di-metilati arricchiti di affinità simmetricamente e asimmetricamente dalle perle di agarosio aggiungendo 50 μL di TFA allo 0,15% a ciascuna provetta (forti condizioni acide, infatti, denaturano l'epitopo portando al rilascio degli antigeni dagli anticorpi). Lasciare questa soluzione 10 minuti a RT, invertendo i tubi ogni 2-3 minuti.
- Trasferire la prima eluizione in provette pulite da 1,5 mL a basso legame e ripetere l'eluizione con 50 μL 0,15% TFA; Raggruppa le 2 frazioni in un tubo.
- Ripetere i passaggi da 7.11 a 7.14 per i peptidi R-mono-metilati che sono stati incubati con le perle anticorpali anti-MMA.
8. Dissalazione e concentrazione di metilpeptidi arricchiti di affinità mediante microcolonne C18 (tempo indicativo richiesto 30 minuti)
- Equilibrare con metanolo le microcolonne C18-RP realizzate con cartucce di estrazione 3M in fase solida per la desalinizzazione e la concentrazione dei peptidi prima dell'analisi MS19.
- Caricare i campioni (corrispondenti alle frazioni arricchite di immunoaffinità separate e alle frazioni in ingresso) sulle microcolonne C18 in due fasi (50 μL + 50 μL su ciascuna microcolonna C18) centrifugando a 600 x g per 6 minuti.
- Lavare le microcolonne con 55 μL di tampone A (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone), sempre mediante centrifugazione a circa 900 x g per 5 minuti.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui, lasciando le microcolonne C18-RP a 4 °C, dove possono essere conservate fino a 2 settimane.
9. Seconda digestione enzimatica (tempo indicativo richiesto 3 ore)
- Lavare le microcolonne C18-RP con 55 μL di tampone A (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone) per due volte, mediante centrifugazione a circa 850 x g per 5 minuti.
- Eluire i peptidi due volte con 20 μL di tampone B (vedere Tabella 1 per la composizione del tampone) e raggruppare le due frazioni.
- Asciugare i peptidi eluiti in un concentratore sottovuoto (vedere Tabella Materiale e reagenti per i dettagli). Nel frattempo, preparare la soluzione di digestione costituita da 50 mM di bicarbonato di ammonio diluito da una soluzione madre 1 M appena fatta (vedere Tabella 1).
- Aggiungere tripsina o LysargiNase ai rispettivi campioni, fino ad una concentrazione finale di 25 ng/μL. Incubare ciascun campione a 37 °C per 2 ore.
- Aggiungere 1 μL di TFA al 5% per fermare la digestione; vortice e spin giù i campioni.
NOTA: La scissione enzimatica da parte della tripsina può essere inibita al C-terminale di R e K metilati, causando scissioni mancate che aumentano la lunghezza e la carica del peptide, che a loro volta producono spettri di frammentazione complessi e incompleti che ostacolano l'identificazione del peptide e l'attribuzione sito-specifica dei siti di metilazione. È stato dimostrato che una seconda digestione enzimatica può ridurre la frequenza di tali scissioni mancate, con una migliore copertura della sequenza e l'attribuzione del sito20.
10. Dissalazione dei peptidi (tempo indicativo richiesto 30 minuti)
- Caricare le soluzioni peptidiche acidificate su nuove microcolonne C18-RP che sono state precedentemente equilibrate seguendo gli stessi passaggi descritti al punto 8.
- Il peptide caricato sulle microcolonne C18-RP può essere conservato a 4 °C fino all'eluizione per l'analisi LC-MS/MS.
11. Analisi cromatografia-spettrometria di massa tandem liquida (LC-MS/MS) (tempo indicativo 5 giorni)
- Eluire i peptidi dalle microcolonne C18-RP passando 10μL di tampone B, centrifugando a 615 x g per 5 minuti a RT. Ripetere questo passaggio due volte e combinare gli eluati.
- Ridurre il volume degli eluati in un concentratore sottovuoto fino a quando non sono quasi asciutti, evitando un'essiccazione eccessiva.
- Risospendere i peptidi in 10 μL di tampone A per l'analisi LC-MS/MS.
- Analizzare ogni frazione di R-metil-peptidi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) in uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (vedi Tabella dei materiali), accoppiato a un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) a nano-flusso. Impostare i parametri dello strumento come descritto nella Tabella 2.
- Caricare 2 μL di ciascun campione su una colonna nanoanalitica (colonna a spruzzo facile diametro interno 75 μm, lunghezza 25 cm), confezionata con resina C18-RP (granulometria 2 μm).
- I campioni vengono fatti passare attraverso la nano-colonna C18 RP ad una portata di 300 nL/min, con il seguente gradiente lineare: 3%-30% B per 89 min, 30%-60% B per 5 min, 60%-95% B per 1 min e 95% B per 5 min.
- Lo spettrometro di massa opera in modalità di acquisizione dipendente dai dati (DDA) per passare automaticamente dall'acquisizione MS a scansione completa all'acquisizione MS/MS. Impostare la scansione completa MS del rilevamento da analizzare nel rivelatore dello spettrometro con risoluzione R = 70.000. I quindici ioni peptide più intensi sono isolati sequenzialmente ad un valore target di 3 x 106 e frammentati da un'energia di collisione relativa del 28%. Impostare i tempi massimi di accumulo di ioni consentiti su 20 ms per scansioni complete e 50 ms per MS/MS e fissare il valore target per MSMS su 1 x 106. Il tempo di esclusione dinamica è impostato su 20 s.
12. Esecuzione dell'analisi dei dati MaxQuant e hmSEEKER
- Al termine delle esecuzioni LC-MS/MS, importare i dati grezzi MS in un motore di ricerca peptidico per identificare i peptidi metilici con un approccio basato sulla probabilità rispetto al database di riferimento. In questo protocollo, MaxQuant versione 1.6.2.10 è stato utilizzato per la nostra analisi. MaxQuant richiede un minimo di 2 GB di RAM per funzionare, nonché spazio su disco sufficiente per memorizzare tutti i dati grezzi e tutti i file di output.
NOTA: Fare riferimento alla documentazione ufficiale di https://www.maxquant.org per tutti i dettagli sull'installazione e sui requisiti hardware e software. - Duplicare ogni file di dati non elaborati. Rinominare gli originali aggiungendo "_light" al loro nome, quindi rinominare le copie aggiungendo "_heavy".
NOTA: hmSEEKER, lo script per l'analisi a valle, fa distinzione tra maiuscole e minuscole. - Avviare la ricerca MaxQuant/Andromeda per l'identificazione del peptide con le impostazioni indicate nella Tabella 3. Dei numerosi dati di output prodotti da MaxQuant, solo i file allPeptides.txt e msms.txt (che si trovano nella sottocartella combined/txt) sono necessari per la fase di post-elaborazione.
- La post-elaborazione dei dati di output MaxQuant viene eseguita dall'algoritmo hmSEEKER. Scarica hmSEEKER da: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Lo script è disponibile come notebook Jupyter scritto in Python 3.7 e viene fornito con un set di dati di esempio a scopo di test. Per i nuovi utenti, è consigliabile scaricare e installare la piattaforma Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). L'ultima versione include di default Python 3.8, Jupyter e tutti i pacchetti necessari per eseguire hmSEEKER (ad esempio, Scikit-learn 0.23.1).
- Creare una cartella e memorizzare i file allPeptides.txt e msms.txt dall'output MaxQuant in essa.
- Avvia Jupyter (dalla riga di comando o dal navigatore Anaconda).
- Passare alla cartella hmSEEKER e aprire hmSEEKER.ipynb.
- Nella sezione Parametri di input del blocco appunti, indicare i percorsi del database FASTA e delle cartelle contenenti i file di testo MaxQuant.
- Esegui il codice all'interno di ogni cella selezionando la cella e facendo clic sul pulsante Riproduci nella parte superiore dell'interfaccia Jupyter.
- Lo script produce un file di output separato da virgole per ogni set di dati analizzato, oltre a un file combinato. L'elenco finale dei doppietti può essere trovato nel file denominato "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(La tabella 4 include una breve descrizione delle colonne nella tabella di output).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'articolo descrive un flusso di lavoro per l'identificazione ad alta affidabilità della R-metilazione globale della proteina, che si basa sulla combinazione della digestione enzimatica dell'estratto proteico con due proteasi distinte in parallelo, seguita dal frazionamento della cromatografia liquida HpH-RP di peptidi proteolitici e dall'arricchimento di immuno-affinità di peptidi R-metilici con anticorpi anti-pan-R-metile (Figura 1).
Le cellule sono state coltivate in presenza di metionina, naturale (Light, L, Met-0) o marcata isotopicamente (Heavy, H, Met-4). Dopo l'etichettatura isotopica completa, che è stata testata mediante analisi MS su una piccola aliquota di estratto solo Met-4, le cellule pesanti e leggere sono state raccolte e miscelate con proporzione 1: 1 L / H, come illustrato nella Figura 1A. Dopo la marcatura metabolica di 3-metionina 13CD, i gruppi metilici vengono aggiunti alla spina dorsale proteica dal donatore metilico S-adenosil-metionina (SAM) e saranno presenti nella forma21 isotopica leggera o pesante. La Figura 1B descrive la reazione di metilazione dell'arginina effettuata dalla famiglia delle Protein Arginina Metiltransferasi (PRMT) che catalizzano il trasferimento di un gruppo metilico dalla S-adenosil metionina (SAM) all'azoto guanidino dell'arginina. Se un singolo gruppo metilico viene posto su uno degli atomi terminali di azoto dell'arginina, si ottiene arginina monometilata (MMA). Se due gruppi metilici vengono aggiunti sullo stesso atomo di azoto del gruppo guanidino, si genera arginina dimetilata asimmetrica (ADMA), mentre se due gruppi metilici sono posti su due diversi atomi di azoto, viene prodotta arginina dimetilata simmetrica (SDMA).
Dopo la miscelazione in cellule marcate con rapporto 1:1 leggero e pesante, le proteine sono state estratte e sottoposte a digestione da Trypsin e LysargiNase, in parallelo. Come mostrato in Figura 2, il gel colorato con Coomassie SDS-PAGE è stato utilizzato per verificare l'efficiente digestione enzimatica delle proteine totali nei peptidi (confrontare le corsie I e II). Inoltre, è stata valutata l'efficienza della fase di purificazione eseguita dalla colonna C18 Sep-Pak, confermando l'assenza di peptidi nel flow-through della colonna C18 (Figura 2, corsia III) e nel primo e secondo lavaggio (Figura 2 corsia IV e V, rispettivamente), con la loro presenza attesa nell'eluato (Figura 2, corsia VI). Sono state valutate la corretta incorporazione di Met-4 nel canale pesante (Figura 2B) e la corretta miscelazione 1:1 H/L (Figura 2C).
La Figura 3 mostra il cromatogramma del frazionamento della cromatografia liquida HpH-RP off-line dei peptidi e la successiva concatenazione non contigua delle frazioni. I peptidi sono stati rilevati da 215 nm UV mentre le proteine non digerite potenzialmente rimanenti sono state valutate da 280 nm UV. Sotto il cromatogramma viene schematizzata la strategia di concatenazione delle frazioni, per ridurre le 70 frazioni iniziali a 16 finali, comprese le frazioni di gradiente PRE e POST.
Gli anticorpi anti-pan-R-metile sono stati utilizzati per l'arricchimento dei peptidi R-metilici. Questi anticorpi riconoscono i tre tipi di R-metilazione (MMA, SDMA e ADMA) e sono disponibili in commercio come direttamente coniugati alle perle di agarosio (vedere Tabella Materiale e reagenti per i dettagli). Nella tabella 1 sono elencati tutti i buffer e le soluzioni utilizzati in questo protocollo.
Dopo l'acquisizione, ogni dato grezzo MS è stato analizzato due volte con MaxQuant, per identificare metilazioni leggere e pesanti in diversi gruppi di ricerca, con la logica che i peptidi metilici (pesanti e leggeri) saranno identificati solo in un gruppo specifico. La ricerca separata di metilazioni pesanti e leggere migliora l'analisi riducendo il numero di modifiche variabili introdotte e riducendo il rischio di peptidi marcati misti falsi positivi. Una volta che MaxQuant ha assegnato i siti metilici, hmSEEKER analizza la sua tabella di output per ricostruire possibili coppie di picchi di luce pesante13.
Le figure 4 e 5 illustrano gli spettri MS completi dei peptidi FELTGIPPAPR(me) (4) e NPPGFAFVEFEDPR(me) (5), che rappresentano rispettivamente un'annotazione di peptide metilico True Positive e una False Positive. Nella figura 4, le differenze m/z osservate tra i tre picchi sono coerenti con la presenza di un residuo metilato enzimaticamente (7,0082 Th tra il non modificato e il metilato leggero; 2,0102 Th tra le forme leggere e pesanti del metil-peptide). Il doppietto hmSILAC risultante ha un ME di 0,40 ppm, un dRT di 0,00 min e un LogRatio di -0,41; questi valori sono inferiori alle soglie predefinite utilizzate da hmSEEKER per distinguere doppietti veri e falsi, che in precedenza era stimato essere il seguente: | ME| < 2 ppm, |dRT| < 0,5 min, e | LogRatio| < 1. Nel secondo caso illustrato nella Figura 5, la differenza m/z osservata tra il peptide metilato alla luce e la sua controparte pesante putativa si discosta dal valore atteso di 0,0312 Th (ME = -37,28 ppm). Inoltre, questo doppietto ha un LogRatio di 2,50, che è al di fuori dell'intervallo di previsione LogRatio predefinito (questi valori limite sono stati definiti e discussi in13). Infatti, nello spettro MS/MS, la sequenza del peptide NPPGFAFVEFEDPR(me) risultava non completamente coperta e la R-metilazione assegnata poteva essere interpretata anche come una metil-esterificazione sul glutammato o sull'aspartato vicino a R.
Il flusso di lavoro hmSEEKER è schematizzato nella Figura 6, mentre la Tabella 4 fornisce una descrizione della tabella di output prodotta da questo strumento, per aiutare l'interpretazione dei risultati: peptidi che portano più modifiche appaiono più volte, ogni voce corrisponde a un diverso evento di metilazione su un dato peptide; infine, i doppietti di picco sono divisi in tre classi: I doppietti abbinati sono i più sicuri, poiché il peptide è stato frammentato e identificato sia nella forma pesante che in quella leggera.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale e delle reazioni enzimatiche proteina-R-metilazione. (A) Diagramma del flusso di lavoro del protocollo biochimico. Le cellule sono coltivate in metionina leggera (Met-0) e pesante (Met-4) contenente terreno per almeno 8 raddoppi e canali leggeri e pesanti sono mescolati proporzione 1: 1. Le proteine vengono estratte e sottoposte a digestione con Tripsina o LysargiNase in parallelo e frazionate mediante cromatografia liquida HpH-RP off-line raccogliendo 70 frazioni, infine combinate in 16 frazioni. I peptidi R-metilici sono arricchiti da anticorpi anti-pan-R-metile coniugati a perle di agarosio, che hanno subito una seconda digestione enzimatica (Tripsina o LysargiNase, rispettivamente) e analizzati da LC-MS / MS. I dati MS grezzi vengono elaborati dall'algoritmo MaxQuant per l'identificazione di peptidi e PTM. I dati di output di MaxQuant vengono quindi sottoposti all'analisi dallo strumento bioinformatico hmSEEKER, sviluppato internamente per l'associazione metil-peptide pesante e leggero. (B) Schema della reazione di R-metilazione. Il gruppo guanidino dell'arginina può essere modificato con l'aggiunta di un gruppo metilico, producendo arginina monometilata (MMA) o mediante l'aggiunta di due gruppi metilici, producendo arginina dimetilata simmetrica (SDMA) o asimmetrica (ADMA). La reazione è catalizzata da enzimi della famiglia delle Protein Arginina Metiltransferasi (PRMTs), che trasferiscono questi gruppi metilici dalla S-Adenosil-Metionina (SAM). Dopo il trasferimento del gruppo metilico, SAM viene ridotto a S-adenosilomocisteina (SAH). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Controlli dei passaggi critici del protocollo. (A) SDS-PAGE Gel colorato con Coomassie per la valutazione dell'efficienza della digestione proteolitica. MW: marcatori di peso molecolare. I) 20 μg di estratto proteico totale di H/L prima della digestione quantificato mediante BCA; II) peptidi digeriti caricati nella stessa proporzione di I; III) flusso passante della cartuccia C18 caricata nella stessa proporzione della corsia I; IV-V) primo e secondo lavaggio della cartuccia C18 con tampone A, caricati nella stessa proporzione di I; VI) eluati dalla cartuccia C18, caricati nella stessa proporzione dell'analisi della velocità di incorporazione I. (B) Met-4. L'incorporazione di Met-4 nel canale pesante viene valutata mediante script sviluppato internamente (disponibile su https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/); tasso = 1 indica la piena incorporazione (C) della distribuzione gaussiana dei rapporti H/L per la valutazione della miscelazione 1:1. Una distribuzione normale del rapporto H/L Log2 è tracciata considerando ±2σ. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Schema di concatenazione della frazione di HpH e valutazione rappresentativa dell'arricchimento dei peptidi R-metilati. (A) Cromatogramma di frazionamento a pH inverso elevato e schema della concatenazione della frazione non contigua. Il cromatogramma rappresenta il profilo di separazione HpH-RP dei peptidi rilevati a 215 nm UV (linea blu), mentre la presenza di proteine non digerite è stata tracciata nel canale UV 280 nm (linea rossa). La linea verde chiaro rappresenta la concentrazione di Buffer B lungo la corsa cromatografica. Viene riportato lo schema di pooling delle frazioni, che descrive la strategia di concatenazione non contigua di frazioni a rilascio precoce, medio e tardivo, da 70 a 16, comprese le frazioni di gradiente PRE e POST. (B) Tabella rappresentativa che riassume l'arricchimento dei peptidi R-metilati. La tabella ricapitola il numero totale di peptidi e la percentuale relativa di arricchimento di R-metilazione confrontando ogni IP sul suo Input. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esempio di vero doppietto hmSILAC. Spettro di massa di un vero doppietto positivo. I picchi visualizzati corrispondono al peptide FELTGIPPAPR nelle forme non modificate, monometilate leggere (CH 3) e monometilate pesanti (13CD3), con carica 2+. Le differenze m/z osservate tra i tre picchi sono coerenti con la presenza di un residuo enzimaticamente metilato. La tabella sotto lo spettro di massa rappresenta l'output di hmSEEKER e contiene i parametri LogRatio, ME e dRT del doppietto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esempio di falso doppietto hmSILAC. Spettro di massa di un'assegnazione negativa in vivo di metil-peptide. I picchi a 811,3849 m/z e 818,3927 m/z corrispondono alle forme monometilate non modificate e leggere del peptide NPPGFAFVEFEDPR, con carica 2+. Il terzo picco potrebbe essere assegnato come controparte metilica pesante del peptide metilato leggero, ma lo spostamento m/z osservato differisce dallo spostamento previsto di 0,0312 Th, il che esclude questa possibilità. La tabella sotto lo spettro di massa rappresenta l'output di hmSEEKER e contiene i parametri LogRatio, ME e dRT del doppietto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro di analisi dei dati. (A) MaxQuant rileva i picchi MS1 nei dati grezzi. (B) I picchi con uno spettro MS2 associato vengono elaborati dal motore di ricerca del database Andromeda per ottenere un'identificazione peptidica. (C) hmSEEKER legge le identificazioni dei peptidi MaxQuant ed estrae i peptidi metilici con punteggio Andromeda > 25, punteggio Delta > 12 e modifiche con una probabilità di localizzazione > 0,75. (D) Per ogni metil-peptide che supera il filtraggio di qualità, hmSEEKER trova il suo corrispondente picco MS1 nella tabella MaxQuant allPeptides e quindi cerca la sua controparte nella stessa tabella. (E) Un doppietto di picchi è definito dalla differenza nel loro tempo di ritenzione (RT), dal loro rapporto di intensità (LogRatio) e dalla deviazione tra la massa delta attesa e osservata (ME); questi tre parametri sono utilizzati da hmSEEKER per distinguere i veri positivi dai falsi positivi, come discusso13. (F) Infine, hmSEEKER produce elenchi di doppiette ridondanti e non ridondanti; Il primo include previsioni per tutti i peptidi metilici, mentre il secondo viene filtrato in modo che quando un peptide viene identificato più volte, viene riportato solo il miglior doppietto di punteggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Buffer | Volume | Composizione |
| Soluzione di L-metionina (L) | 10ml | 30mg/mL Luce-Metionina in acqua ultrapura |
| Soluzione di L-metionina (H) | 10ml | 30mg/mL Metionina pesante in acqua ultrapura |
| Terreno di coltura cellulare | 500mL | DMEM con glutammina stabile e senza metionina, FBS dializzato al 10% (v/v), 1% (v/v) P/S, soluzione di L-metionina 1:1000 (v/v) |
| Tampone di lisi | 50ml | 9M Urea, 20mM HEPES pH 8,0;1% (v/v) inibitore della proteasi; 1% (v/v) Inibitore della fosfatasi in acqua ultrapura |
| Soluzione di bicarbonato di ammonio (AMBIC) | 50ml | 1M (NH4)2CO3 in acqua ultrapura |
| Soluzione DTT | 10ml | 1.25M DTT in acqua ultrapura |
| Soluzione IAA | 5ml | 109mM in acqua ultrapura |
| Solvente A per Sep-Pak C18 | 50ml | 0,1% TFA in acqua ultrapura |
| Solvente B per Sep-Pak C18 | 50ml | 0,1% TFA + 40% ACN in acqua ultrapura |
| Soluzione di lavaggio per Sep-Pak C18 | 50ml | 0,1% TFA + 5% ACN in acqua ultrapura |
| Tampone A per frazionamento HpH | 500mL | 25 mM NH4OH in acqua ultrapura |
| Tampone B per frazionamento HpH | 500mL | 25 mM NH4OH+ 90% ACN in acqua ultrapura |
| Buffer di binding IP 1x | 5ml | Diluite 1:10 (V/v) in acqua ultrapura da 10 volte disponibile in commercio |
| Buffer di eluizione IP | 50ml | 0,15% TFA in acqua ultrapura |
| Buffer A per le descrizioni | 50ml | 0,1% TFA in acqua ultrapura |
| Buffer B per le punte di fase | 50ml | 0,1% TFA + 40% ACN in acqua ultrapura |
| Buffer C per le punte di fase | 50ml | 0,1% TFA + 50% ACN in acqua ultrapura |
| MS Solvente A | 250mL | 0,1% FA in acqua ultrapura |
| MS Solvente B | 250mL | 0,1% FA + 80% ACN in acqua ultrapura |
| Cocktail di inibitori della proteasi | 5 ml | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Tablets (ROCHE) disciolto in acqua ultrapura secondo le istruzioni di fabbricazione |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi | 5 ml | PhosSTOP compresse (ROCHE) sciolte in acqua ultrapura secondo le istruzioni di fabbricazione |
Tabella 1: Composizione dei buffer e delle soluzioni. Elenchi dei buffer e delle soluzioni utilizzati in questo protocollo.
| Parametri | Valore |
| Caricamento campioni (uL) | 2 |
| Portata di carico (uL/min) | 10 |
| Portata gradiente (nL/min) | 300 |
| Gradiente lineare | 3-30% B per 89min, 30-60% B per 5min, 60-95% B per 1min, 95% B per 5min |
| Risoluzione di scansione completa | 70,000 |
| Numero di ioni più intensi selected | 15 |
| Energia di collisione relativa (%) (CID) | 28 |
| Esclusione dinamica (s) | 20.0 |
Tabella 2: impostazione LC-MS/MS. Parametri applicati per l'analisi LC-MS/MS di peptidi R-metilici su uno spettrometro di massa Quadrupole-Orbitrap ad alta risoluzione, accoppiato a un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) a nano-flusso.
| Impostazioni parametri MQ (versione 1.6.2.10) | |||
| Impostazione | Azione | ||
| Configurazione | |||
| Modifiche | Met4 | Aggiungi nuova modifica. Impostate Composizione su H(-3) Hx(3) Cx C(-1) e scegliete M come specificità. | |
| Metil4 (KR) | Duplicare "Metile (KR)", rinominarlo e cambiare la composizione in Cx H(-1) Hx(3) | ||
| Dimetil4 (KR) | Duplicare "Dimetile (KR)", rinominarlo e cambiare la composizione in H(-2) Hx(6) Cx(2) | ||
| Trimetil4 (K) | Duplicare "Trimetile (K)", rinominarlo e cambiare composizione in Cx(3) H(-3) Hx(9) | ||
| OxMet4 | Duplicare "Ossidazione (M)" e rinominarlo. | ||
| Proteasi | Lisarginasi | Aggiungi nuova proteasi. Seleziona le colonne 'R' e 'K'. | |
| Quando si crea un nuovo PTM o proteasi, fare clic su "Modifica tabella" per modificare le impostazioni MaxQuant e quindi su "Salva modifiche" per confermare le modifiche. Riavvia MaxQuant e le nuove opzioni saranno visibili. | |||
| Scheda File raw | |||
| Gruppo Parametri | Separare i file raw in 2 gruppi (0 e 1) | ||
| Parametri specifici del gruppo | |||
| Digitare | Digitare | Standard | |
| Molteplicità | 1 | ||
| Digestione | Enzima | Tripsina o lisarginasi | |
| Max. Scollature mancate | Impostato su 3 | ||
| Modifiche | Modifiche variabili | Gruppo 0 | Ossidazione (M), Metile (KR), Dimetile (KR), Trimetile (K) |
| Gruppo 1 | OxMet4, Metil4 (KR), Dimetil4 (KR), Trimetil4 (K) | ||
| Modifiche corrette | Gruppo 0 | Carbamidometilazione | |
| Gruppo 1 | Carbamidometilazione e Met4 | ||
| Parametri globali | |||
| Sequenze | File Fasta | Carica file FASTA | |
| Identificazione | PSM FDR | Impostato su 0.01 | |
| Punteggio minimo per peptidi modificati | Impostato su 1 | ||
| Punteggio Delta minimo per peptidi modificati | Impostato su 1 | ||
| Identificazione avanzata | Seconda ricerca peptidica | Spunta | |
| Tabelle | Scrivi la tabella allPeptides | Assegno | |
| Avanzato | Calcolare le proprietà dei picchi | Assegno | |
| Se non viene specificato, lasciare il parametro predefinito. | |||
| Impostazioni dei parametri MQ per il test di incorporazione | |||
| Parametri specifici del gruppo | |||
| Digitare | Digitare | Standard | |
| Molteplicità | 2 | ||
| Numero massimo di etichette | 5 | ||
| Etichetta pesante | Seleziona Met4 | ||
| Digestione | Enzima | Tripsina o lisarginasi | |
| Max. Scollature mancate | Impostato su 3 | ||
| Modifiche | Modifiche variabili | Ossidazione (M) | |
| Modifiche corrette | Carbamidometilazione | ||
| Se non viene specificato, lasciare il parametro predefinito. | |||
Tabella 3: parametri di elaborazione MaxQuant. Sono elencati i parametri specifici del gruppo e globali adattati all'esperimento specifico descritto. Tutti gli altri parametri sono stati impostati come predefiniti, a seconda della versione del programma utilizzata.
| Nome colonna | Descrizione |
| File grezzo | File di dati grezzi in cui è stato identificato il doppietto |
| H-Scan | Numero di scansione della controparte pesante |
| L-Scan | Numero di scansione della controparte luminosa |
| .CLASS | Può avere 3 valori: |
| Abbinato = I peptidi pesanti e leggeri sono identificati con la stessa sequenza | |
| Non corrispondente = I peptidi pesanti e leggeri hanno la stessa sequenza aa ma c'è una discrepanza nella localizzazione del sito metilato | |
| Salvato = Viene identificato un solo peptide nel doppietto; La sua controparte è un picco non identificato. | |
| PEPTIDE | Sequenza peptidica |
| PUNTEGGIO | Punteggio Peptide Andromeda |
| RES | Residuo modificato |
| POS | Posizione del residuo modificato |
| MOD | Modifica |
| PROTEINE DI PIOMBO | Proteina a cui appartiene il peptide |
| GENE | Nome del gene corrispondente alla proteina |
| PROBABILITY_TRUE | Probabilità che il doppietto sia un vero doppietto hmSILAC, calcolata dal modello di regressione logistica |
| PREDIZIONE | 1 se il doppietto è putativo vero, 0 se è falso |
| RAPPORTO H/L | Log2 del rapporto intensità pesante/leggera |
| ME | Deviazione tra differenza di massa attesa e osservata |
| DRT | Differenza nel tempo di conservazione |
Tabella 4: descrizione dei risultati dell'output di hmSEEKER. Elenco delle voci di colonna nella tabella di output hmSEEKER, con una breve descrizione del loro contenuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'identificazione ad alta confidenza della metilazione in vivo di proteine/peptidi mediante proteomica globale basata sulla SM è impegnativa, a causa del rischio di FDR elevato, con diverse sostituzioni di aminoacidi e metil-esterificazione che si verificano durante la preparazione del campione che sono isobariche alla metilazione e possono causare assegnazioni errate in assenza di strategie di convalida ortogonali della SM. La natura substechiometrica di questo PTM complica ulteriormente il compito della metil-proteomica globale, ma può essere superata con l'arricchimento selettivo di peptidi modificati10.
Qui viene presentato un flusso di lavoro biochimico e analitico, progettato per aumentare l'efficienza e l'affidabilità dell'analisi MS globale dei peptidi R-metilici attraverso l'applicazione della strategia hmSILAC accoppiata al frazionamento del peptide cromatografico HpH-RP e all'arricchimento di affinità con kit anticorpali anti-pan-R-metil-peptidi. La prima strategia consente la validazione ortogonale dei peptidi metilici e riduce fortemente il FDR di identificazione, mentre il secondo protocollo aumenta la loro rilevabilità dallo sfondo di peptidi non modificati22. Tuttavia, una limitazione di questo protocollo è il requisito di una quantità molto grande di estratto proteico iniziale (nell'intervallo di 20-40 mg) come input per il successivo frazionamento del peptide e l'arricchimento dell'affinità, che limita l'applicazione del metodo a linee cellulari immortalizzate e a crescita rapida che possono essere ampiamente espanse. Invece, l'attuale configurazione non è applicabile alle cellule o ai tessuti primari derivati dal paziente. Le indagini future dovrebbero essere indirizzate a migliorare il protocollo in questa direzione: ulteriori strategie per l'arricchimento biochimico del peptide metilato rispetto a quelli non modificati potrebbero consentire di aggirare l'uso di anticorpi, consentendo il ridimensionamento degli esperimenti. Un altro sviluppo interessante potrebbe essere rappresentato dalla combinazione dei metodi attuali con la modificazione chimica di peptidi proteolitici con tag di massa isobarica o tandem, con due potenziali vantaggi: da un lato, la possibilità di combinare più condizioni in un unico esperimento, multiplexando così la quantificazione relativa dei cambiamenti metil-proteomici su diverse perturbazioni; D'altra parte, raggruppare campioni diversi in uno prima del frazionamento cromatografico e dell'arricchimento dell'affinità può consentire di ridurre la scala dei singoli esperimenti.
Questo protocollo si basa su due digestioni separate dell'intero estratto cellulare in parallelo con Trypsin e LysargiNase. La tripsina fende il legame peptidico sul lato C-terminale dei residui K e R, generando peptidi che presentano un residuo caricato positivamente al C-terminale, oltre alla carica positiva N-terminale della α-ammina23. L'enzima LysargiNase idrolizza selettivamente i legami peptidil-K e -R, generando peptidi che portano un K o R nel sito N-terminale, che può includere forme K-metilate. L'uso di entrambe le proteasi aumenta la copertura complessiva del proteoma nell'analisi MS su larga scala, portando all'identificazione di peptidi eventualmente mancati su una singola digestione triptica18. La doppia digestione enzimatica, invece, viene effettuata per ridurre il numero di possibili scissioni enzimatiche mancate. Infatti, la metilazione di K e R riduce fortemente l'efficienza della scissione proteica da parte della tripsina. Nonostante questa precauzione, è ancora comune che i peptidi metilati siano più lunghi e contengano scissioni mancate, che portano a una scarsa frammentazione del CID.
L'uso di un altro tipo di frammentazione, come la dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD), potrebbe risolvere questo problema. È un dato di fatto, l'ETD di solito non frammenta gli ioni peptidici doppiamente carichi in modo efficiente come fa il CID, ma fornisce una scissione abbastanza uniforme dei precursori peptidici di stati di carica più elevati (≥3). Questo potrebbe essere un vantaggio nel caso della R-metilazione, poiché si verifica frequentemente in domini ricchi di arginina che contengono residui R multipli e vicini. Tuttavia, ETD ha una velocità di scansione inferiore rispetto al CID, quindi il numero totale di identificazioni peptidiche è ridotto24,25,26.
Recentemente, diversi protocolli che comportano l'arricchimento di peptidi modificati post-traduzionalmente sono stati accoppiati con diverse strategie di separazione cromatografica che aiutano a ridurre la complessità della miscela peptidica, aumentando così l'efficienza complessiva del rilevamento di peptidi modificati nella SM. Qui viene applicato il frazionamento cromatografico HpH-RP accoppiato con la concatenazione non contigua delle frazioni. Il frazionamento peptidico off-line basato su una cromatografia a fase inversa ad alto pH mostra una separazione ad alto potere risolutivo che è ortogonale alla separazione RP a basso pH in linea effettuata a valle durante la corsa LC-MS/MS27. Inoltre, la strategia di concatenazione non contigua ha due vantaggi principali: in primo luogo, aumenta la copertura proteica raggruppando frazioni a rilascio precoce, medio e tardivo in singole frazioni concatenate, preservando l'eterogeneità della miscela peptidica. In secondo luogo, la concatenazione riduce la successiva analisi del runtime MS, acquisendo un numero inferiore di frazioni del campione28.
A causa della natura substechiometrica della R-metilazione, è necessaria una fase di arricchimento per facilitare la rilevazione di metil-peptidi nell'analisi globale MS dei proteomi di modificazione. In questo protocollo, i peptidi metilici sono arricchiti mediante precipitazione di immuno-affinità (IAP) utilizzando gli anticorpi anti-SDMA e anti-ADMA in parallelo, mentre l'immuno-precipitazione di mono-metil-peptidi utilizzando anticorpi anti-MMA viene effettuata sugli FT dei precedenti esperimenti IAP. Questo ordine riflette la diversa efficienza di questi anticorpi: gli anticorpi anti-SDMA e anti-ADMA hanno un'efficienza di legame inferiore rispetto agli anticorpi anti-MMA. Degno di nota, questa diversa efficienza può anche causare distorsioni nella rappresentazione dei diversi gradi di R-metilazioni in modifica-proteomi annotati sperimentalmente29.
Prima della disponibilità commerciale degli anticorpi anti-pan-R-metilazione, sono state applicate altre strategie di separazione per aumentare il rilevamento del peptide R-metilato da parte della SM, come lo scambio cationico forte (SCX) e l'interazione idrofila (HILIC). Nonostante queste tecniche potessero ridurre la complessità della miscela peptidica analizzata nella SM, non hanno migliorato significativamente l'identificazione dei peptidi metilici30,31,32,33.
Nonostante tutte queste soluzioni tecniche e analitiche volte ad aumentare la separazione, il rilevamento, la frammentazione e l'annotazione della sequenza metil-peptide, la copertura del metil-proteoma è ancora limitata e orientata verso le proteine metilate più abbondanti, come la ribonucleoproteina, le elicasi leganti l'RNA, mentre diverse proteine modificate note a bassa abbondanza (ad esempio, TP53BP1, CHTF8, MCM2) vengono rilevate solo in modo fortuito e non affidabile su più esperimenti globali34 . Il frazionamento subcellulare applicato prima dell'attuale flusso di lavoro potrebbe migliorare la rilevazione di tali proteine; Tuttavia, l'attuale scala sperimentale richiesta non rende questa un'alternativa praticabile.
Sulla SM, i dati grezzi vengono analizzati attraverso l'algoritmo MaxQuant per l'identificazione di peptidi e PTM. L'analisi dei dati degli esperimenti hmSILAC non è, tuttavia, semplice con algoritmi di ricerca standard. Ad esempio, mentre MaxQuant può analizzare in modo efficiente gli esperimenti SILAC standard basati sull'etichettatura metabolica con K e R codificati isotopicamente, non funziona in modo efficiente quando l'etichettatura isotopica è codificata in un PTM variabile, come nel caso dell'etichettatura pesante-metilica che porta alla metilazione pesante. Pertanto, la strategia adottata qui consiste nell'analizzare prima i dati hmSILAC con MaxQuant senza utilizzare la sua funzionalità di ricerca doppietta incorporata in modo che i peptidi leggeri e pesanti possano essere identificati indipendentemente; Quindi vengono abbinati a un software di post-elaborazione. Questo flusso di lavoro bioinformatico ha anche le sue insidie, poiché è necessario specificare le metilazioni sia in forme pesanti che leggere nel pannello Modifiche variabili di MaxQuant, finendo con un totale di otto modifiche variabili quando è inclusa anche l'ossidazione della metionina (pesante e leggera). La ricerca di troppi PTM con un motore di ricerca di database come MaxQuant/Andromeda è poco pratica, perché porta ad un aumento esponenziale dei peptidi teorici che l'algoritmo deve testare: la nostra soluzione è stata quella di analizzare ogni dato grezzo MS due volte, con diversi set di PTM variabili (attraverso la funzione dei gruppi di parametri di MaxQuant). Dopo la ricerca peptidica, lo strumento sviluppato internamente hmSEEKER viene impiegato per supportare l'assegnazione di coppie di peptidi pesanti-leggeri dalle tabelle di output prodotte da MaxQuant. La prima versione dell'algoritmo hmSEEKER è stata recentemente pubblicata13, dove è stato dimostrato che hmSEEKER può identificare doppietti hmSILAC con FDR < 1%. I falsi positivi possono ancora derivare da coppie di picchi che per caso hanno un multiplo di differenza di massa di 4,02 Da, ma questo è molto improbabile per i doppietti classificati come Matched o Mismatched, alla luce dei seguenti fatti: affinché un doppietto Matched o Mismatched sia falso, Andromeda deve determinare erroneamente la sequenza sia della controparte pesante che di quella leggera. Supponendo che il motore di ricerca sia stato eseguito con i suoi parametri predefiniti, ogni identificazione ha una probabilità dell'1% di essere errata. Pertanto, la probabilità che anche la controparte hmSILAC sia errata è dello 0,01%.
Una trappola di hmSILAC è che i peptidi contenenti metionina nella loro spina dorsale generano anche doppietti che sono indistinguibili da quelli generati dai peptidi metilici. Tuttavia, dalla nostra esperienza, questo non dovrebbe rappresentare un grosso problema, in primo luogo perché i peptidi senza metilazioni possono essere semplicemente scartati dall'output MaxQuant e, in secondo luogo, perché hmSEEKER tiene automaticamente conto di qualsiasi residuo di metionina in un peptide metilico nel calcolo della differenza di massa attesa; infine, questo rischio è escluso anche dal fatto che le modifiche pesanti e leggere sono ricercate in gruppi di parametri separati, in modo che il motore di ricerca non possa suddividere una monometilazione pesante (+18,03 Da) in una monometilazione leggera più una metionina pesante (14,01 + 4,02 Da).
Una soluzione più formale e sperimentale a questo problema è stata proposta da Oreste Acuto e dai suoi collaboratori, che hanno sviluppato una variante di hmSILAC, chiamata isometionina metil-SILAC (iMethyl-SILAC)22. In questo protocollo di marcatura metabolica alternativo, la metionina a luce naturale è sostituita da [13 C 4]-metionina, che ha la stessa massa di [13CD3]-metionina (Met-4), ma non produce gruppi metilici stabili codificati isotopicamente, a causa della diversa distribuzione degli isotopi pesanti all'interno del tag molecolare. Pertanto, negli esperimenti iMethyl-SILAC, i peptidi contenenti metionina non modificati non generano doppietti. Tuttavia, va notato che quando Acuto e collaboratori hanno confrontato le prestazioni di iMethyl-SILAC e hmSILAC tradizionale, i due metodi mostravano ancora FDR molto simili.
Una possibile limitazione di hmSEEKER è che è progettato per funzionare direttamente sulle tabelle di output MaxQuant in modo che il suo codice sorgente non sia compatibile con altri motori di ricerca, i cui file di output sono strutturati in modo diverso; in questo senso, MethylQuant35 fornisce un buon strumento bioinformatico alternativo che è adattato ad hoc per l'analisi diretta dei dati grezzi MS da esperimenti di tipo hmSILAC ed è più flessibile in termini di file di input forniti. È in fase di sviluppo un modello di apprendimento automatico per distinguere i doppietti H/L veri e falsi del peptide metilico senza fare affidamento su soglie definite dall'utente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
MM ed EM sono studenti di dottorato all'interno della Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM). EM è il destinatario di una borsa di studio FIRC-AIRC di 3 anni (Codice progetto: 22506). Le analisi globali di R-metil-proteomi nel gruppo TB sono supportate dall'AIRC IG Grant (Codice progetto: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
