Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma
Summary
Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.
Abstract
El pez cebra se ha convertido en un importante modelo animal para estudiar las enfermedades humanas, especialmente el cáncer. Junto con las robustas tecnologías de edición transgénica y genómica aplicadas en el modelado del pez cebra, la facilidad de mantenimiento, la productividad de alto rendimiento y las potentes imágenes en vivo en conjunto hacen del pez cebra un valioso sistema modelo para estudiar la metástasis y las bases celulares y moleculares subyacentes a este proceso in vivo. El primer modelo de metástasis de neuroblastoma (NB) del pez cebra se desarrolló sobreexpresando dos oncogenes, MYCN y LMO1, bajo control del promotor dopamina-beta-hidroxilasa (dβh). La coexpresión de MYCN y LMO1 condujo a la reducción de la latencia y al aumento de la penetrancia de la neuroblastomagénesis, así como a la metástasis a distancia acelerada de las células tumorales. Este nuevo modelo reitera de manera confiable muchas características clave de la NB metastásica humana, incluida la participación de alteraciones genéticas clínicamente relevantes y asociadas a metástasis; desarrollo natural y espontáneo de metástasis in vivo; y sitios conservados de metástasis. Por lo tanto, el modelo de pez cebra posee ventajas únicas para diseccionar el complejo proceso de metástasis tumoral in vivo.
Introduction
El pez cebra ha sido ampliamente utilizado y aplicado a varias áreas de investigación, especialmente en cáncer. Este modelo proporciona muchas ventajas, como su reproducción robusta, mantenimiento rentable y visualización versátil del crecimiento tumoral y la metástasis, todo lo cual hace del pez cebra una herramienta poderosa para estudiar e investigar las bases celulares y moleculares de la tumorigénesis y la metástasis. Las nuevas técnicas para el mapeo del genoma a gran escala, la transgénesis, la sobreexpresión o eliminación de genes, el trasplante de células y las pantallas químicas han aumentado enormemente el poder del modelo del pez cebra1. Durante los últimos años, se han desarrollado muchas líneas de pez cebra para estudiar la tumorigénesis y la metástasis de una variedad de cánceres humanos, que incluyen, entre otros, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma y carcinoma hepatocelular2,3,4,5. Además, el primer modelo de pez cebra de neuroblastoma (NB) se generó mediante la sobreexpresión de MYCN, un oncogén, en el sistema nervioso simpático periférico (PSNS) bajo el control del promotor dopamina-beta-hidroxilasa (dβh). Con este modelo, se demostró además que la ALK activada puede sinergizarse con MYCN para acelerar la aparición del tumor y aumentar la penetrancia tumoral in vivo6.
El NB se deriva del linaje simpaticoadrenal de las células de la cresta neural, y es un cáncer altamente metastásico en niños7. Es responsable del 10% de las muertes pediátricas relacionadas con el cáncer8. Ampliamente metástasis en el momento del diagnóstico, el NB puede presentarse clínicamente como tumores originados principalmente a lo largo de la cadena de los ganglios simpáticos y la médula suprarrenal de PSNS9,10. La amplificación de MYCN se asocia comúnmente con malos resultados en pacientes con NB11,12. Además, el LMO1 ha sido identificado como un gen crítico de susceptibilidad al NB en casos de alto riesgo13,14. Los estudios encontraron que la coexpresión transgénica de MYCN y LMO1 en el PSNS del modelo de pez cebra no solo promueve la aparición más temprana de NB, sino que también induce metástasis generalizadas en los tejidos y órganos que son similares a los sitios comúnmente vistos en pacientes con NB13 de alto riesgo. Muy recientemente, también se ha observado otro fenotipo metastásico de NB en un nuevo modelo de pez cebra de NB, en el que tanto MYCN como Lin28B, que codifican una proteína de unión a ARN, se sobreexpresan bajo el control del promotor dβh16.
El abordaje transgénico estable en el pez cebra se utiliza a menudo para estudiar si la sobreexpresión de un gen de interés podría contribuir al desarrollo normal y a la patogénesis de la enfermedad14,15. Esta técnica se ha utilizado con éxito para demostrar la importancia de múltiples genes y vías para la tumorigénesis NB6,16,17,18,19,20. Este trabajo presentará cómo se creó la línea de peces transgénicos que sobreexpresa tanto MYCN como LMO1 en el PSNS y cómo se demostró que la cooperación de estos dos oncogenes acelera la aparición de tumorigénesis NB y metástasis13. En primer lugar, la línea transgénica que sobreexpresa EGFP-MYCN bajo control del promotor dβh (línea designada MYCN) se desarrolló inyectando la construcción dβh-EGFP-MYCN en una etapa unicelular de embriones AB de tipo salvaje (WT), como se describió anteriormente6,17. Se desarrolló una línea transgénica separada que sobreexpresa LMO1 en la PSNS (línea designada LMO1) mediante la coinyectación de dos construcciones de ADN, dβh-LMO1 y dβh-mCherry, en embriones WT en la etapa de una célula13. Se ha demostrado previamente que las construcciones de ADN doble coinyectadas se pueden cointegradar en el genoma de los peces; por lo tanto, LMO1 y mCherry se coexpresan en las células PSNS de los animales transgénicos. Una vez que los embriones F0 inyectados alcanzaron la madurez sexual, se cruzaron con peces WT para la identificación de peces positivos con integración de transgénes. Brevemente, la descendencia F1 se examinó por primera vez mediante microscopía fluorescente para la expresión de mCherry en las células PSNS. La integración de la línea germinal de LMO1 en peces mCherry-positivos se confirmó aún más mediante PCR genómica y secuenciación. Después de la identificación exitosa de cada línea transgénica, la progenie de peces transgénicos heterocigotos MYCN y LMO1 se cruzaron para generar una línea de peces compuestos que expresan tanto MYCN como LMO1 (designado MYCN; Línea LMO1). MYCN portador de tumores; Los peces LMO1 fueron monitoreados por microscopía fluorescente quincenalmente para detectar la evidencia de tumores metastásicos en las regiones distantes al sitio primario, región de la glándula interrenal (IRG, equivalente al pez cebra de la glándula suprarrenal humana)13. Confirmar la metástasis de tumores en MYCN; Se aplicaron análisis de peces LMO1, histológicos e inmunohistoquímicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra se ha utilizado comúnmente en la investigación durante las últimas décadas, especialmente en la investigación del cáncer, por razones obvias, como su facilidad de mantenimiento, reproducción robusta y claras ventajas para la imagen in vivo1,28. El modelo de pez cebra puede manipularse fácilmente embrionariamente debido a su fertilización y desarrollo externo, lo que complementa bien a los organismos modelo de mamíferos, como ratas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención R01 CA240323 (S.Z.) del Instituto Nacional del Cáncer; una subvención W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) del Departamento de Defensa de los Estados Unidos (DoD); un premio V Scholar de la V Foundation for Cancer Research (S.Z.) y una beca platform del Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); y el apoyo del Centro Oncológico de Mayo Clinic y del Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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