Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli
Summary
Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1’in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.
Abstract
Zebra balığı, başta kanser olmak üzere insan hastalıklarını incelemek için önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Zebra balığı modellemesinde uygulanan sağlam transgenik ve genom düzenleme teknolojilerinin yanı sıra, bakım kolaylığı, yüksek verimli üretkenlik ve güçlü canlı görüntüleme, zebra balığını metastaz ve bu sürecin altında bulunan hücresel ve moleküler temelleri vivo olarak incelemek için değerli bir model sistemi haline getirir. Metastazın ilk zebra balığı nöroblastom (NB) modeli, dopamin-beta-hidroksilyaz (dβh) promotörünün kontrolü altında iki onkogen, MYCN ve LMO1 aşırı ifade ederek geliştirilmiştir. Birlikte ifade edilen MYCN ve LMO1, nöroblastomagenezisin gecikmesinin azalmasına ve penetrancesinin artmasına ve tümör hücrelerinin uzak metastazlarının hızlanmasına yol açtı. Bu yeni model, klinik olarak ilgili ve metastazla ilişkili genetik değişikliklerin katılımı da dahil olmak üzere insan metastatik NB’nin birçok temel özelliklerini güvenilir bir şekilde yineler; metastaz in vivo doğal ve spontan gelişimi; ve metastaz sitelerini korumuş. Bu nedenle, zebra balığı modeli, tümör metastazının karmaşık sürecini in vivo olarak parçalamak için benzersiz avantajlara sahiptir.
Introduction
Zebra balığı, özellikle kanserde çeşitli araştırma alanlarına yaygın olarak kullanılmış ve uygulanmıştır. Bu model, sağlam üremesi, uygun maliyetli bakımı ve tümör büyümesi ve metastazının çok yönlü görselleştirilmesi gibi birçok avantaj sağlar- bunların hepsi zebra balığını tümöregenez ve metastazın hücresel ve moleküler bazlarını incelemek ve araştırmak için güçlü bir araç haline getirir. Büyük ölçekli genom haritalama, transgenez, genlerin aşırı ifade edilmesi veya nakavt edilmesi, hücre nakli ve kimyasal ekranlar için yeni teknikler zebra balığı modelinin gücünü son derece artırmıştır1. Son birkaç yıl içinde, lösemi, melanom, rabdomyosarkom ve hepatosellüler karsinom2,3,4,5 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli insan kanserlerinin tümörjenezi ve metastazını incelemek için birçok zebra balığı hattı geliştirilmiştir. Ek olarak, nöroblastom (NB) ilk zebra balığı modeli, dopamin-beta-hidroksilaz (dβh) promotörünün kontrolü altındaki periferik sempatik sinir sisteminde (PSNS) bir onkogen olan MYCN’nin aşırı ifade edilmesiyle üretildi. Bu model ile aktif ALK’nın tümör başlangıcını hızlandırmak ve in vivo6’daki tümör penetrance’ını artırmak için MYCN ile sinerjiye sahip olabileceği daha da gösterilmiştir.
NB, nöral kret hücrelerinin sympathoadrenal soyundan türetilmiştir ve çocuklarda oldukça metastatik bir kanserdir7. Pediatrik kansere bağlı ölümlerin %10’undan sorumludur8. Tanıda yaygın olarak metastaz yapılan NB, klinik olarak öncelikle sempatik gangliyon zinciri ve PSNS9,10’un adrenal medullası boyunca ortaya çıkan tümörler olarak sunulabilir. MYCN amplifikasyonu genellikle NB hastalarında kötü sonuçlarla ilişkilidir11,12. Ayrıca LMO1, yüksek riskli olgularda kritik NB duyarlılık geni olarak tanımlanmıştır13,14. Çalışmalar, zebra balığı modelinin PSNS’sinde MYCN ve LMO1’in transgenik koexpressasyonunun sadece NB’nin daha erken başlamasını teşvik etmekle kalmayıp, aynı zamanda yüksek riskli NB13 hastalarında yaygın olarak görülen bölgelere benzeyen doku ve organlara yaygın metastaz yaptığını buldu. Çok yakın zamanda, bir RNA bağlayıcı proteini kodlayan MYCN ve Lin28B’nin dβh promotörü16’nın kontrolü altında aşırı ifade edildiği daha yeni bir zebra balığı NB modelinde NB’nin başka bir metastatik fenotipi de gözlenmiştir.
Zebra balıklarındaki kararlı transgenik yaklaşım genellikle ilgi çekici bir genin aşırı ekspresyonunun normal gelişime ve hastalık patogenezine katkıda bulunup bulunamayacağını incelemek için kullanılır14,15. Bu teknik, NB tümörjenezis6,16,17,18,19,20’ye giden birden fazla gen ve yolun önemini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Bu makale, PSNS’de hem MYCN hem de LMO1’i aşırı ifade eden transgenik balık hattının nasıl oluşturulduğunu ve bu iki onkogenin işbirliğinin NB tümörjenezi ve metastaz13’ün başlangıcını nasıl hızlandırdığının nasıl gösterildiğini tanıtacaktır. İlk olarak, dβh promotörünün (mycn hattı olarak belirlenmiş) kontrolü altındaki EGFP-MYCN’yi aşırı ifade eden transgenik hat, dβh-EGFP-MYCN yapısı daha önce açıklandığı gibi vahşi tip (WT) AB embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte ederek geliştirilmiştir6,17. PSNS’de LMO1’i (LMO1 hattı olarak belirlenmiş) aşırı ifade eden ayrı bir transgenik hat, dβh-LMO1 ve dβh-mCherry olmak üzere iki DNA yapısı tek hücreli aşamada WT embriyolarına dönüştürülerek geliştirilmiştir13. Daha önce, sikkelenmiş çift DNA yapılarının balık genomuna kazınabileceği gösterilmiştir; bu nedenle, LMO1 ve mCherry transgenik hayvanların PSNS hücrelerinde birlikte ifade edilir. Enjekte edilen F0 embriyoları cinsel olgunluğa ulaştığında, transgene(ler) entegrasyonu ile pozitif balıkların tanımlanması için WT balıklarıyla aşıldılar. Kısaca, F1 yavruları ilk olarak PSNS hücrelerinde mCherry ekspresyolü için floresan mikroskopi ile tarandı. LMO1’in mCherry pozitif balıklara germline entegrasyonu genomik PCR ve dizileme ile daha da doğrulandı. Her transgenik hattın başarılı bir şekilde tanımlanmasından sonra, heterozipöz MYCN ve LMO1 transgenik balıklarının soyu, hem MYCN hem de LMO1’i ifade eden bileşik bir balık hattı oluşturmak için iç içe geçti (MYCN olarak belirlenmiştir; LMO1 hattı). Tümör taşıyan MYCN; LMO1 balıkları, birincil bölgeye uzak bölgelerde metastatik tümörlerin, interrenal bez bölgesinin (IRG, insan adrenal bezine eşdeğer zebra balığı eşdeğeri) kanıtı için iki haftada bir floresan mikroskopi ile izlendi 13. MYCN’deki tümörlerin metastazını doğrulamak için; LMO1 balıkları, histolojik ve immünohistokimyasal analizler uygulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı, son birkaç on yıldır, özellikle kanser araştırmalarında, bakım kolaylığı, sağlam üremesi ve in vivo görüntüleme için açık avantajları gibi bariz nedenlerden dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır1,28. Zebra balığı modeli, büyük ölçekli genetik çalışmalar için sıçanlar ve fareler gibi memeli model organizmaları iyi tamamlayan dış döllenmeleri ve gelişimleri nedeniyle embriyonik olarak kolayca manip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü’nden R01 CA240323 (S.Z.) hibesi ile desteklendi; Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı’ndan (DoD) W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) hibesi; V Kanser Araştırmaları Vakfı’ndan (S.Z.) V Scholar ödülü ve Mayo Biyomedikal Keşif Merkezi’nden (S.Z.) platform hibesi; ve Mayo Clinic Kanser Merkezi ve Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi’nden (S.Z.) destek almaktadır.
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children’s oncology group’s 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors’ progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
