神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル
Summary
本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。
Abstract
ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患、特に癌を研究するための重要な動物モデルとして浮上している。ゼブラフィッシュのモデリングに適用される堅牢なトランスジェニックおよびゲノム編集技術に加えて、メンテナンスの容易さ、高収率の生産性、および強力なライブイメージングにより、ゼブラフィッシュは、このプロセスの根底にある転移および細胞および分子基盤をインビボで研究するための貴重なモデルシステムとなっています。転移の最初のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫(NB)モデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で、2つの癌遺伝子、MYCNおよびLMO1を過剰発現させることによって開発された。MYCNおよびLMO1を共発現させることは、神経芽細胞腫形成の潜伏期間の減少および浸透度の増加、ならびに腫瘍細胞の遠隔転移の加速をもたらした。この新しいモデルは、臨床的に関連する遺伝子改変および転移関連遺伝子改変の関与を含む、ヒト転移性NBの多くの重要な特徴を確実に繰り返している。インビボでの転移の自然および自発的な発生;転移の保存された部位。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、インビボでの腫瘍転移の複雑なプロセスを解剖するユニークな利点を有する。
Introduction
ゼブラフィッシュは広く使用されており、特に癌において、いくつかの研究分野に適用されています。このモデルは、堅牢な再生、費用対効果の高いメンテナンス、腫瘍の成長と転移の汎用性の高い視覚化など、多くの利点を提供し、ゼブラフィッシュを腫瘍形成と転移の細胞および分子基盤を研究および調査するための強力なツールにします。大規模なゲノムマッピング、トランスジェネシス、遺伝子の過剰発現またはノックアウト、細胞移植、および化学スクリーニングのための新しい技術は、ゼブラフィッシュモデルの力を非常に増強しました1。過去数年間、白血病、黒色腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌を含むがこれらに限定されない様々なヒト癌の腫瘍形成および転移を研究するために、多くのゼブラフィッシュ系統が開発されてきた2,3,4,5。さらに、神経芽細胞腫(NB)の最初のゼブラフィッシュモデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で末梢交感神経系(PSNS)において癌遺伝子であるMYCNを過剰発現させることによって生成された。このモデルでは、活性化ALKがMYCNと相乗作用して腫瘍発症を加速し、vivoでの腫瘍浸透度を高めることができることがさらに実証されました6。
NBは神経堤細胞の交感神経副腎系譜に由来し、小児において転移性の高い癌である7。小児がん関連死の10%を占めています8。診断時に広く転移したNBは、主にPSNS9,10の交感神経節および副腎髄質の鎖に沿って起源とする腫瘍として臨床的に提示され得る。MYCN増幅は、NB患者における転帰不良と一般的に関連している11、12。さらに、LMO1は高リスク症例において重要なNB感受性遺伝子として同定されている13,14。ゼブラフィッシュモデルのPSNSにおけるMYCNとLMO1のトランスジェニック共発現は、NBの早期発症を促進するだけでなく、高リスクNB13患者で一般的に見られる部位に類似した組織および器官への広範な転移を誘導することも研究によって見出された。ごく最近、NBの新しいゼブラフィッシュモデルでもNBの別の転移表現型が観察されており、RNA結合タンパク質をコードするMYCNとLin28Bの両方がdβhプロモーターの制御下で過剰発現している16。
ゼブラフィッシュにおける安定したトランスジェニックアプローチは、目的の遺伝子の過剰発現が正常な発育および疾患の病因に寄与するかどうかを研究するためによく使用されます14,15。この技術は、NB腫瘍形成に対する複数の遺伝子および経路の重要性を実証するために首尾よく使用されている6、16、17、18、19、20。本稿では、PSNSにおいてMYCNとLMO1の両方を過剰発現するトランスジェニックフィッシュラインがどのように作られたのか、そしてこれら2つのがん遺伝子の協力がNB腫瘍形成と転移の発症を加速させることがどのように実証されたかを紹介します13。まず、dβhプロモーターの制御下でEGFP-MYCNを過剰発現するトランスジェニック株(MYCN株と命名)を、先に説明したように、dβh-EGFP-MYCN構築物を野生型(WT)AB胚の1細胞段階に注入することによって開発した6,17。PSNSでLMO1を過剰発現する別のトランスジェニック株(LMO1株と命名)は、2つのDNA構築物dβh-LMO1と dβh-mCherryをWT胚に1細胞段階で同時注入することによって開発された13。共注入された二重DNA構築物が魚のゲノムに共統合され得ることが以前に実証されている。したがって、LMO1およびmCherryは、トランスジェニック動物のPSNS細胞において共発現される。注入されたF0胚が性的成熟に達すると、それらはWT魚と交配され、導入遺伝子が組み込まれた陽性魚の同定が行われた。簡単に説明すると、F1の子孫を、PSNS細胞におけるmCherry発現について蛍光顕微鏡によって最初にスクリーニングした。mCherry陽性魚類におけるLMO1の生殖細胞系列の組み込みを、ゲノムPCRおよびシーケンシングによってさらに確認した。各トランスジェニック系統の同定に成功した後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1トランスジェニック魚の子孫を交配して、MYCNおよびLMO1の両方を発現する複合魚系統(MYCNと命名;LMO1 行)。担癌性MYCN;LMO1魚類を隔週で蛍光顕微鏡によりモニターし、原発部位から離れた領域、腎間領域(IRG、ヒト副腎のゼブラフィッシュと同等)における転移性腫瘍の証拠について13。MYCNにおける腫瘍の転移を確認するために;LMO1魚類、組織学的および免疫組織化学的分析を適用した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、メンテナンスの容易さ、堅牢な再生、in vivoイメージングの明確な利点などの明白な理由から、過去数十年間、特にがん研究で一般的に使用されてきました1,28。ゼブラフィッシュモデルは、大規模な遺伝学的研究のために、ラットやマウスなどの哺乳類モデル生物をうまく補完する外部受精および発達のために、胚的に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立がん研究所からの助成金R01 CA240323(S.Z.)によって支援された。米国国防総省(DoD)からの助成金W81XWH-17-1-0498(S.Z.)。V Foundation for Cancer Research(S.Z.)のV奨学生賞とMayo Center for Biomedical Discovery(S.Z.)のプラットフォーム助成金。メイヨークリニックがんセンターと個別化医療センター(S.Z.)からの支援。
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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