Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma
Summary
Este artigo introduz o método de desenvolver, caracterizar e rastrear em tempo real a metástase tumoral no modelo de zebrafish de neuroblastoma, especificamente na linha de zebrafish transgênico com superexpressão de MYCN e LMO1, que desenvolve metástase espontaneamente.
Abstract
O zebrafish emergiu como um importante modelo animal para estudar doenças humanas, especialmente o câncer. Juntamente com as robustas tecnologias transgênicas e de edição de genomas aplicadas na modelagem de zebrafish, a facilidade de manutenção, produtividade de alto rendimento e poderosa imagem ao vivo fazem do zebrafish um valioso sistema modelo para estudar metástase e bases celulares e moleculares subjacentes a esse processo in vivo. O primeiro modelo de metástase do neuroblastoma de zebrafish (NB) foi desenvolvido superexpressando dois oncogenes, MYCN e LMO1, sob controle do promotor de dopamina-beta-hidroxilase (dβh). O MYCN e o LMO1 co-superexpressos levaram à redução da latência e ao aumento da penetração da neuroblastomagênese, bem como à metástase distante acelerada das células tumorais. Este novo modelo reitera de forma confiável muitas características-chave da NB metastática humana, incluindo o envolvimento de alterações genéticas clinicamente relevantes e associadas à metástase; desenvolvimento natural e espontâneo da metástase in vivo; e locais conservados de metástases. Portanto, o modelo de zebrafish possui vantagens únicas para dissecar o complexo processo de metástase tumoral in vivo.
Introduction
O zebrafish tem sido amplamente utilizado e aplicado em diversas áreas de pesquisa, especialmente no câncer. Este modelo oferece muitas vantagens – como sua reprodução robusta, manutenção econômica e visualização versátil do crescimento tumoral e metástase- tudo isso faz do zebrafish uma ferramenta poderosa para estudar e investigar as bases celulares e moleculares de tumorigênese e metástase. Novas técnicas para mapeamento de genomas em larga escala, transgênese, superexpressão ou nocaute de genes, transplante de células e telas químicas aumentaram imensamente o poder do modelo de zebrafish1. Nos últimos anos, muitas linhas de zebrafish foram desenvolvidas para estudar tumorigênese e metástase de uma variedade de cânceres humanos, incluindo, mas não se limitando à leucemia, melanoma, rabdomiossarcoma e carcinoma hepatocelular2,3,4,5. Além disso, o primeiro modelo de zebrafish de neuroblastoma (NB) foi gerado pela superexpressão mycn, um oncogene, no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob controle do promotor dopamina-beta-hidroxilase (dβh). Com este modelo, foi demonstrado ainda que a ALK ativada pode sinergizar com MYCN para acelerar o aparecimento do tumor e aumentar a penetração do tumor no vivo6.
NB é derivado da linhagem simpática das células da crista neural, e é um câncer altamente metastático em crianças7. É responsável por 10% das mortes relacionadas ao câncer pediátrico8. Amplamente metástase no diagnóstico, a NB pode ser clinicamente apresentada como tumores originários principalmente ao longo da cadeia da gânglio simpático e da medula adrenal de PSNS9,10. A amplificação do MYCN está comumente associada a desfechos ruins em pacientes com NB11,12. Além disso, o LMO1 foi identificado como um gene crítico de suscetibilidade de NB em casos de alto risco13,14. Estudos descobriram que a coexpressão transgênica de MYCN e LMO1 no PSNS do modelo de zebrafish não só promove o início precoce do RN, mas também induz metástase generalizada aos tecidos e órgãos semelhantes aos locais comumente vistos em pacientes com NB13 de alto risco. Muito recentemente, outro fenótipo metastático de NB também foi observado em um modelo mais recente de zebrafish de NB, no qual tanto MYCN quanto Lin28B, codificando uma proteína de ligação de RNA, são superexpressos sob controle do promotor dβh16.
A abordagem transgênica estável no zebrafish é frequentemente usada para estudar se a superexpressão de um gene de interesse poderia contribuir para o desenvolvimento normal e a patogênese da doença14,15. Esta técnica tem sido usada com sucesso para demonstrar a importância de múltiplos genes e caminhos para a tumorigênese do RN6,16,17,18,19,20. Este artigo introduzirá como a linha de peixes transgênicos que sobreexpressa tanto o MYCN quanto o LMO1 no PSNS foi criada e como foi demonstrado que a cooperação desses dois oncogenes acelera o surgimento da tumorigênese e metástase do NB13. Primeiro, a linha transgênica que sobreexpressa o EGFP-MYCN sob controle do promotor dβh (linha MYCN designada) foi desenvolvida injetando a construção dβh-EGFP-MYCN em um estágio de uma célula de embriões AB do tipo selvagem (WT), como descrito anteriormente6,17. Uma linha transgênica separada que sobreexpressa lMO1 na linha PSNS (designada LMO1) foi desenvolvida por cunhar duas construções de DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, em embriões WT no estágio de uma célula13. Foi demonstrado anteriormente que construções de DNA duplo coinjetados podem ser cunhadas no genoma do peixe; portanto, LMO1 e mCherry são coexpressos nas células PSNS dos animais transgênicos. Uma vez que os embriões F0 injetados atingiram a maturidade sexual, eles foram então superados com peixes WT para a identificação de peixes positivos com integração transgene(s). Resumidamente, a prole F1 foi examinada pela primeira vez por microscopia fluorescente para expressão mCherry nas células PSNS. A integração germinal de LMO1 em peixes mCherry-positivo foi confirmada ainda por PCR genômico e sequenciamento. Após a identificação bem sucedida de cada linha transgênica, a prole de peixes transgênicos HEterozigous MYCN e LMO1 foram interladas para gerar uma linha de peixes compostos expressando tanto MYCN quanto LMO1 (denominada MYCN; Linha LMO1). MYCN portador de tumor; Os peixes LMO1 foram monitorados por microscopia fluorescente quinzenalmente para a evidência de tumores metastáticos nas regiões distantes do local primário, região da glândula interrenal (IRG, zebrafish equivalente à glândula adrenal humana)13. Confirmar a metástase dos tumores no MYCN; Foram aplicadas análises histológicas e imunohistoquímicas de peixes LMO1, histológicas e imunohistoquímicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O zebrafish tem sido comumente utilizado em pesquisas nas últimas décadas, especialmente em pesquisas sobre câncer, por razões óbvias, como sua facilidade de manutenção, reprodução robusta e claras vantagens para a imagem in vivo1,28. O modelo de zebrafish pode ser facilmente manipulado embrionáriamente devido à sua fertilização e desenvolvimento externo, o que complementa bem aos organismos modelos de mamíferos, como ratos e camundongos, p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa R01 CA240323 (S.Z.) do Instituto Nacional de Câncer; uma subvenção W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (DoD); um prêmio V Scholar da V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e uma Bolsa de Plataforma do Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e suportes do Mayo Clinic Cancer Center e Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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