Sebrafisk modell av Neuroblastoma Metastasis

Summary

Dette dokumentet introduserer metoden for å utvikle, karakterisere og spore i sanntid tumormetastase i sebrafiskmodell av nevroblastom, spesielt i den transgene sebrafisklinjen med overekspresjon av MYCN og LMO1, som utvikler metastase spontant.

Abstract

Sebrafisk har dukket opp som en viktig dyremodell for å studere menneskelige sykdommer, spesielt kreft. Sammen med de robuste transgene og genomredigeringsteknologiene som brukes i sebrafiskmodellering, gjør enkel vedlikehold, høy avkastning produktivitet og kraftig levende bildebehandling helt sebrafisken til et verdifullt modellsystem for å studere metastase og cellulære og molekylære baser som ligger til grunn for denne prosessen in vivo. Den første sebrafisk neuroblastom (NB) modellen av metastase ble utviklet ved å overekspressere to oncogenes, MYCN og LMO1, under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Co-overekspressert MYCN og LMO1 førte til redusert latens og økt penetrans av nevroblastomagenese, samt akselerert fjern metastase av tumorceller. Denne nye modellen gjentar pålitelig mange viktige trekk ved human metastatisk NB, inkludert involvering av klinisk relevante og metastaseringsrelaterte genetiske endringer; naturlig og spontan utvikling av metastase in vivo; og bevarte områder av metastaser. Derfor har sebrafiskmodellen unike fordeler for å dissekere den komplekse prosessen med tumormetastase in vivo.

Introduction

Sebrafisk har blitt mye brukt og anvendt på flere forskningsområder, spesielt i kreft. Denne modellen gir mange fordeler – for eksempel robust reproduksjon, kostnadseffektivt vedlikehold og allsidig visualisering av tumorvekst og metastase – som alle gjør sebrafisk til et kraftig verktøy for å studere og undersøke cellulære og molekylære baser av tumorigenesis og metastase. Nye teknikker for storskala genomkartlegging, transgenese, genovertrykk eller knockout, celletransplantasjon og kjemiske skjermer har enormt forsterket kraften i sebrafiskmodellen1. I løpet av de siste årene har mange sebrafisklinjer blitt utviklet for å studere tumorigenesis og metastase av en rekke menneskelige kreftformer, inkludert, men ikke begrenset til leukemi, melanom, rabdomyosarcoma og hepatocellulært karsinom2,3,4,5. I tillegg ble den første sebrafiskmodellen av nevroblastom (NB) generert ved å overekspressere MYCN, en oncogene, i det perifere sympatiske nervesystemet (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Med denne modellen ble det videre demonstrert at aktivert ALK kan synergisere med MYCN for å akselerere tumor utbruddet og øke tumorgjennomtrengende in ^vivo6.

NB er avledet fra den sympodrenale avstamningen av nevrale kamceller, og er en svært metastatisk kreft hos ^barn7. Det er ansvarlig for 10% av barnekreftrelaterte ^dødsfall8. Nb er bredt metastasert ved diagnose, og kan presenteres klinisk som svulster som hovedsakelig stammer fra kjeden av det sympatiske gangliaet og binyremedullaen til ^PSNS9,10. MYCN-forsterkning er ofte forbundet med dårlige utfall hos NB-pasienter11,12. Videre er LMO1 identifisert som et kritisk NB-følsomhetsgen i høyrisikotilfeller13,14. Studier fant at den transgene coexpression av MYCN og LMO1 i PSNS av sebrafiskmodellen ikke bare fremmer tidligere utbrudd av NB, men også induserer utbredt metastase til vev og organer som ligner steder som vanligvis ses hos pasienter med høyrisiko ^NB13. Svært nylig har en annen metastatisk fenotype av NB også blitt observert i en nyere sebrafiskmodell av NB, der både MYCN og Lin28B, som koder et RNA-bindende protein, er overekspressert under kontroll av dβh-promotoren16.

Den stabile transgene tilnærmingen i sebrafisk brukes ofte til å studere om overekspressering av et gen av interesse kan bidra til normal utvikling og sykdomspatogenese14,15. Denne teknikken har blitt brukt til å demonstrere betydningen av flere gener og veier til NB tumorigenesis6,16,17,18,19,20. Dette dokumentet vil introdusere hvordan den transgene fiskelinjen som overekspresserer både MYCN og LMO1 i PSNS ble opprettet og hvordan det ble demonstrert at samarbeidet mellom disse to oncogenes akselerere utbruddet av NB tumorigenesis og metastase13. For det første ble den transgene linjen som overekspresserer EGFP-MYCN under kontroll av dβh-promotoren (utpekt MYCN-linje) utviklet ved å injisere dβh-EGFP-MYCN-konstruksjonen i encellet stadium av wild-type (WT) AB embryoer, som tidligere ^{beskrevet6,17}. En egen transgen linje som overekspresserer LMO1 i PSNS (utpekt LMO1-linje) ble utviklet ved å mynte to DNA-konstruksjoner, dβh-LMO1 og dβh-mCherry, til WT-embryoer på encellet ^stadium13. Det har tidligere blitt demonstrert at myntede doble DNA-konstruksjoner kan myntes inn i fiskegenomet; Derfor er LMO1 og mCherry coexpressed i PSNS-cellene til de transgene dyrene. Når de injiserte F0-embryoene nådde seksuell modenhet, ble de deretter krysset med WT-fisk for identifisering av positiv fisk med transgene (er) integrasjon. Kort sagt ble F1-avkom først screenet av fluorescerende mikroskopi for mCherry-uttrykk i PSNS-cellene. Bakterieintegrasjonen av LMO1 i mCherry-positiv fisk ble ytterligere bekreftet av genomisk PCR og sekvensering. Etter vellykket identifisering av hver transgeniske linje ble avkommet av heterozygot MYCN og LMO1 transgen fisk interbred for å generere en sammensatt fiskelinje som uttrykker både MYCN og LMO1 (utpekt MYCN; LMO1-linje). Tumorbærende MYCN; LMO1 fisk ble overvåket av fluorescerende mikroskopi to uker for bevis på metastatiske svulster i regionene fjernt til det primære stedet, interrenal kjertel region (IRG, sebrafisk tilsvarende menneskelig binyrene)¹³. For å bekrefte metastase av svulster i MYCN; LMO1 fisk, histologiske og immunhiistokjemiske analyser ble brukt.

Protocol

Alle forskningsmetoder ved bruk av sebrafisk og dyrepleie/vedlikehold ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer ved Mayo Clinic. 1. Forberedelse og mikroinjeksjon av transgene konstruksjoner for utvikling av LMO1 transgen sebrafisk linje med overekspression i PSNS For å utvikle LMO1-pDONR221-klonen , forsterker du kodeområdet til human LMO1 fra cDNA oppnådd fra menneskelig cellelinje ved hjelp av PCR. Gjør en 25 μL reaksjon som b…

Representative Results

For å avgjøre om LMO1 synergiserer med MYCN for å påvirke NB-patogenese, ble transgene konstruksjoner som driver uttrykk for enten LMO1 (dβh:LMO1 og dβh:mCherry) eller MYCN (dβh:EGFP-MYCN) i PSNS-cellene under kontroll av dβh-promotoren injisert i sebrafiskembryoer13. Som illustrert i figur 1A, etter utviklingen av stabile transgene linjer og validering av deres genotyper, ble heterozygot …

Discussion

Sebrafisk har blitt ofte brukt i forskning de siste tiårene, spesielt i kreftforskning, av åpenbare grunner, for eksempel enkel vedlikehold, robust reproduksjon og klare fordeler for in vivo-avbildning1,28. Sebrafiskmodellen kan lett manipuleres embryonalt på grunn av deres eksterne befruktning og utvikling, som utfyller godt til pattedyrmodellorganismer, som rotter og mus, for store genetiske ^studier1,2,3<sup class=…

Materials

3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028	(DBH construct)
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL