في المختبر تحريض الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري نحو أنساب البنكرياس
Summary
يقدم هذا البروتوكول مقارنة بين بروتوكولين تعريفيين مختلفين للتمييز بين الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري (hDPSCs) نحو أنساب البنكرياس في المختبر:البروتوكول التكاملي والبروتوكول غير التكاملي. يولد البروتوكول التكاملي المزيد من الخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs).
Abstract
اعتبارا من عام 2000 ، ونجاح زرع جزيرة البنكرياس باستخدام بروتوكول ادمونتون لعلاج مرض السكري من النوع الأول لا تزال تواجه بعض العقبات. وتشمل هذه العدد المحدود من المتبرعين البنكرياس الجثث والاستخدام طويل الأجل لمثبطات المناعة. تعتبر الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) مرشحا محتملا كمصدر بديل لتوليد خلايا تشبه الجزيرة. وقد أوضحت تقاريرنا السابقة بنجاح وضع بروتوكولات تعريفية للتمييز بين الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري (hDPSCs) والخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs). ومع ذلك، تباينت كفاءة الاستقراء بشكل كبير. في هذه الورقة، نبين مقارنة كفاءة تحريض البنكرياس hDPSCs عن طريق بروتوكولات تعريفية تكاملية (التلاعب بالبيئات الدقيقة والجينية) وبروتوكولات تعريفية غير تكاملية (التلاعب بالبيئات الدقيقة) لتقديم IPCs المشتقة من hDPSC (hDPSC-IPCs). النتائج تشير إلى كفاءة التعريفي متميزة لكلا النهج التعريفي من حيث هيكل مستعمرة 3 الأبعاد, العائد, علامات مرنا البنكرياس, والممتلكات وظيفية على التحدي الجلوكوز متعددة الجرعة. وستدعم هذه النتائج إنشاء مراكز IPCs منطبقة سريريا ومنصة لإنتاج نسب البنكرياس في المستقبل.
Introduction
مرض السكري هو مصدر قلق عالمي مستمر. وقدر تقرير للاتحاد الدولي للسكري أن الانتشار العالمي لمرض السكري سيرتفع من 151 مليون في عام 2000 إلى 415 مليون في عام 20151،2. وقد توقعت أحدث دراسة قائمة على علم الأوبئة أن انتشار مرض السكري في جميع أنحاء العالم المقدر سيرتفع من 451 مليون في عام 2017 إلى 693 مليون في عام 20451. وقد تجلى نجاح زرع جزيرة البنكرياس باستخدام بروتوكول ادمونتون لأول مرة في عام 2000، عندما ثبت للحفاظ على إنتاج الأنسولين الذاتية وتحقيق الاستقرار في حالة normoglycemic في النوع الأول مرضى السكري3. ومع ذلك، فإن تطبيق بروتوكول إدمونتون لا يزال يواجه مشكلة اختناق. العدد المحدود من المتبرعين البنكرياس الجثث هي القضية الرئيسية منذ كل مريض مع مرض السكري من النوع الأول يتطلب ما لا يقل عن 2-4 المتبرعين الجزيرة. وعلاوة على ذلك, استخدام على المدى الطويل من العوامل المثبطة للمناعة قد يسبب آثار جانبية تهدد الحياة4,5. ولمعالجة هذا الأمر، ركز تطوير علاج محتمل لمرض السكري في العقد الماضي بشكل رئيسي على توليد خلايا فعالة منتجة للأنسولين (IPCs) من مصادر مختلفة للخلايا الجذعية6.
أصبحت الخلايا الجذعية علاجا بديلا في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض السكري من النوع الأول، والذي يسببه فقدان خلايا بيتا. زرع IPCs هو الأسلوب الواعد الجديد للسيطرة على جلوكوز الدم في هؤلاء المرضى7. 10- وفي هذه المقالة، يعرض نهجان لإنشاء مراكز تشجيع الاستثمار، وهما بروتوكولات تعريف التكاملية وغير التكاملية. بروتوكول التعريفي تحاكي عملية نمو البنكرياس الطبيعية للحصول على IPCs ناضجة وظيفية8,9.
لهذه الدراسة، وتميزت hDPSCs من قبل قياس التدفق الخلوي للكشف عن علامة سطح MSC، وإمكانات التمايز متعدد الخطوط، وRT-qPCR لتحديد التعبير عن خاصية الجذعية وعلامات الجينات التكاثرية (البيانات غير مبين)8،9،10. تم حث hDPSCs نحو الاندوديرم النهائي ، بطانة البنكرياس ، الغدد الصماء البنكرياسية ، وخلايا بيتا البنكرياسية أو IPCs (الشكل 1) ، على التوالي7. للحث على الخلايا، تم استخدام نهج التعريفي من ثلاث خطوات كبروتوكول العمود الفقري. كان يسمى هذا البروتوكول بروتوكول غير تكاملي. في حالة البروتوكول التكاملي ، كان عامل النسخ البنكرياسي الأساسي ، PDX1، مفرط التعبير في hDPSCs يليه تحريض PDX1 مفرط التعبير في hDPSCs باستخدام بروتوكول تمايز من ثلاث خطوات. الفرق بين البروتوكول غير التكاملي والتكاملي هو التعبير المفرط عن PDX1 في البروتوكول التكاملي وليس في البروتوكول غير التكاملي. تمت مقارنة تمايز البنكرياس بين البروتوكولات التكاملية وغير التكاملية في هذه الدراسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يؤدي تحقيق إنتاج أعلى من الشركات عبر بروتوكول الإنترنت من الشركات ذات التصلب المتعدد دورا أساسيا في علاج مرض السكري. تعتمد الخطوات الحاسمة للبروتوكول التكاملي على جودة الخلايا التي ستستخدم في النقل ونوعية الخلايا المنقولة. بعض متطلبات الخلية التي يجب التحقق من تحويلها بنجاح هي ضمان صحة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم SK وWR وQDL من قبل وحدة أبحاث الخلايا الجذعية البيطرية والهندسة الحيوية ، صندوق الوقف Ratchadaphiseksomphot ، جامعة شولالونغكورن. تم دعم TO و PP من قبل تشولالونغكورن التقدم الأكاديمي في مشروعها القرن2. وقد تم دعم CS من خلال منحة دعم بحثية من كلية العلوم البيطرية ، والتقدم الأكاديمي Chulalongkorn في مشروع القرن الثاني ، والخلايا الجذعية البيطرية ووحدة أبحاثالهندسة الحيوية ، وصندوق الوقف Ratchadaphiseksomphot ، وجامعة شولالونغكورن ، وصندوق البحوث الحكومية.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton’s jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
