Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu
Summary
Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC’ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.
Abstract
2000 yılı itibariyle, tip I diabetes mellitus tedavisinde Edmonton protokolünü kullanarak pankreas adacık naklinin başarısı hala bazı engellerle karşı karşıya kaldı. Bunlar arasında sınırlı sayıda kadavra pankreas bağışçısı ve immünsüpresanların uzun süreli kullanımı saydır. Mezenkimal kök hücreler (MSC’ ler) adacık benzeri hücre neslinin alternatif bir kaynağı olarak potansiyel bir aday olarak kabul edilmiştir. Önceki raporlarımız, insan diş hamuru kök hücrelerini (hDC’ler) insülin üreten hücrelere (IPC’ ler) ayırt etmek için indüksiyon protokollerinin oluşturulmasını başarıyla ortaya koymuştur. Bununla birlikte, indüksiyon verimliliği büyük ölçüde değişti. Bu yazıda, hDPSC türevli IPC’ler (hDPSC-IPC’ler) sunmak için bütünleştirici (mikroçevresel ve genetik manipülasyon) ve bütünleştirici olmayan (mikroçevronmental manipülasyon) indüksiyon protokolleri yoluyla hDPSC’lerin pankreas indüksiyon verimliliğinin karşılaştırılması gösterilmiştir. Sonuçlar, 3 boyutlu koloni yapısı, verim, pankreas mRNA belirteçleri ve çok dozajlı glikoz zorluğu üzerine fonksiyonel özellik açısından hem indüksiyon yaklaşımları için belirgin indüksiyon verimliliği göstermektedir. Bu bulgular, klinik olarak uygulanabilir bir IPC’lerin ve pankreas soy üretim platformunun gelecekteki kurulmasını destekleyecektir.
Introduction
Diabetes mellitus devam eden küresel bir endişe kaynağıdır. Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) raporunda, diyabetin küresel prevalansının 2000 yılında 151 milyondan 2015 yılında 415 milyona yükseleceği tahmin edilmektedir1,2. Epidemiyoloji temelli en son çalışma, dünya çapında tahmini diyabet prevalansının 2017’de 451 milyondan 2045’te 693 milyona yükseleceğini öngörtü1. Edmonton protokolü kullanılarak pankreas adacık naklinin başarısı ilk olarak 2000 yılında, tip I diyabetik hastalarda endojen insülin üretiminin sürdürülmesi ve normoglisemik durumun stabilize edildiği gösterildiğinde gösterilmiştir3. Ancak, Edmonton protokolünün uygulanması hala bir darboğaz sorunuyla karşı karşıyadır. Tip I diyabetli her hasta en az 2-4 adacık bağışçısı gerektirdiğinden, kadavra pankreas donörlerinin sınırlı sayıda olması ana konudur. Ayrıca, immünsüpresif ajanların uzun süreli kullanımı hayatı tehdit eden yan etkilere neden olabilir4,5. Bunu ele almak için, son on yılda diyabet için potansiyel bir tedavinin geliştirilmesi, esas olarak çeşitli kök hücre kaynaklarından etkili insülin üreten hücrelerin (IPC’ ler) üretimine odaklanmıştır6.
Kök hücreler, beta hücrelerinin kaybından kaynaklanan diyabet tipi I de dahil olmak üzere birçok hastalıkta alternatif bir tedavi haline geldi. İP’lerin nakli, bu hastalarda kan şekerinin kontrol altına için yeni umut verici yöntemdir7. BU makalede, IPC’ler oluşturmak için bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan indüksiyon protokolleri olmak üzere iki yaklaşım sunulmuştur. İndüksiyon protokolü, olgunlaşmış ve işlevsel IPC’leri elde etmek için doğal pankreas gelişim sürecini taklit etti8,9.
Bu çalışma için hDCPCs, MSC yüzey belirteci tespiti için akış sitometrisi, çok satırlı farklılaşma potansiyeli ve rt-qPCR ile karakterize edildi ve sap özelliği ve proliferatif gen belirteçlerinin (veri gösterilmedi) ekspresyonunu belirlemek için8,9,10. hDC’ler kesin endoderm, pankreas endoderm, pankreas endokrin ve pankreas beta hücreleri veya IPC’lere indüklenmiştir (Şekil 1), sırasıyla7. Hücreleri indüklamak için omurga protokolü olarak üç aşamalı indüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Bu protokole bütünleştirici olmayan protokol denirdi. Bütünleştirici protokol durumunda, temel pankreas transkripsiyon faktörü PDX1,hDC’lerde aşırı ifade edildi ve ardından üç adımlı bir farklılaşma protokolü kullanılarak hDC’lerde aşırı ifade edilen PDX1 indüksiyonu yapıldı. Bütünleştirici olmayan ve bütünleştirici protokol arasındaki fark, PDX1’in bütünleştirici olmayan protokolde değil, bütünleştirici protokolde aşırı ifade olmasıdır. Pankreas farklılaşması bu çalışmada bütünleştirici ve bütünleştirici olmayan protokoller arasında karşılaştırıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSC’lerden daha yüksek IPC üretimi elde etmek diyabet tedavisinde önemli bir rol oynar. Bütünleştirici protokolün kritik adımları, transdüksiyon için kullanılacak hücrelerin kalitesine ve transdüklenmiş hücrelerin kalitesine dayanır. Başarılı transdüksiyon için kontrol edilmesi gereken bazı hücre gereksinimleri, hücre sağlığını, hücre bankacılığı yönetimini ve hücrelerin mitotik olarak aktif bir durumda olmasını sağlamaktır. Ayrıca, transdüklenmiş hücrelerin canlılığını i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SK, WR ve QDL, Chulalongkorn Üniversitesi Veteriner Kök Hücre ve Biyomühendislik Araştırma Birimi, Ratchadaphiseksomphot Bağış Fonu tarafından desteklendi. TO ve PP, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi tarafından2. CS, VeterinerLik Fakültesi, Chulalongkorn Akademik İlerlemesi2.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton’s jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
