시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도
Summary
이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.
Abstract
2000년 현재, 에드먼튼 프로토콜을 사용하여 췌장 이식의 성공은 여전히 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이들은 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수 및 면역 억제제의 장기 사용을 포함합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) islet 같은 세포 생성의 대체 소스로 잠재적인 후보로 간주 되었습니다. 우리의 이전 보고서는 성공적으로 인슐린 생산 세포 (CFC)에 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 유도 프로토콜의 설립을 설명했다. 그러나 유도 효율은 크게 다양했습니다. 이 논문에서는 hDPSC 유래 IpC(hDPSC-IpC)를 전달하기 위한 통합(마이크로 환경 및 유전 조작) 및 비통합(microenvironmental 조작) 유도 프로토콜을 통한 hDPSCs 췌장 유도 효율의 비교를 시연합니다. 결과는 다중 복용량 포도당 도전에 3 차원 식민지 구조, 수율, 췌장 mRNA 마커 및 기능성 속성의 관점에서 유도 접근 둘 다에 대한 뚜렷한 유도 효율을 건의합니다. 이러한 사실 인정은 임상적으로 적용 가능한 IpC 및 췌장 계보 생산 플랫폼의 미래 설립을 지원할 것입니다.
Introduction
당뇨병은 지속적인 글로벌 관심사입니다. 국제 당뇨병 연맹(IDF) 보고서에 따르면 당뇨병의 전 세계 보급률은 2000년 1억 5,100만 명에서 2015년 4억 1,500만 명으로 증가할 것으로추정했다. 최신 역학 기지를 둔 연구 결과는 추정된 세계적인 당뇨병 보급이 2017년에 4억 5천1백만에서 2045년1년에693,000,000로 증가할 것이라는 점을 예측했습니다. 에드먼튼 프로토콜을 이용한 췌장적 이식의 성공은 2000년에 처음 입증되었으며, 내인성 인슐린 생산을 유지하고 I형 당뇨병 환자3에서노모글리세믹 상태를 안정화시키는 것으로 나타났다. 그러나 Edmonton 프로토콜의 적용은 여전히 병목 현상에 직면해 있습니다. 타입-I 당뇨병을 가진 각 환자는 적어도 2-4 islet 기증자를 필요로 하기 때문에 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수는 주요 문제점입니다. 더욱이, 면역억제제의 장기간 사용은 생명을 위협하는부작용4,5를유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해 지난 10년간 당뇨병에 대한 잠재적 치료법의 개발은 주로 다양한 줄기 세포6에서효과적인 인슐린 생산 세포(IpC)의 생성에 초점을 맞추고 있다.
줄기 세포는 베타 세포의 손실에 기인하는 당뇨병 타입 I를 포함하여 많은 질병에서 대체 처리가 되었습니다. IpC의 이식은 이들 환자에서 혈당을 조절하는 새로운 유망한 방법입니다7. 통합 및 비통합 유도 프로토콜인 IpC 생성을 위한 두 가지 방법이 이 문서에서 제시됩니다. 유도 프로토콜은 성숙하고 기능적인 IPC8,9를얻기 위해 자연 췌장 발달 과정을 모방했다.
이 연구를 위해, hDPSC는 MSC 표면 마커 검출, 다중리 분화 전위 및 RT-qPCR을 위한 유동 세포측정을 특징으로 하여 줄기 성질 및 증식 유전자 마커(data)의 발현을 결정하기 위해8,9,10. hDPSC는 최종 내막, 췌장 내분비, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포 또는 IpC(도 1)를향해 각각7을유도하였다. 세포를 유도하기 위해, 3단계 유도 접근법은 백본 프로토콜로 사용되었다. 이 프로토콜을 통합되지 않는 프로토콜이라고 합니다. 통합 프로토콜의 경우, 필수 췌장 전사 인자 인 PDX1은hDPSC에서 과발현된 PDX1을 3단계 분화 프로토콜을 사용하여 hDPSC에서 과도하게 발현되었다. 통합되지 않는 프로토콜과 통합 프로토콜의 차이점은 통합 프로토콜이 아닌 통합 프로토콜에서 PDX1의 과발현입니다. 췌장 분화는 이 연구에서 통합 및 비 통합 프로토콜 사이에서 비교되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MsC에서 더 높은 IpC 생산을 달성하는 것은 당뇨병 치료에 필수적인 역할을합니다. 통합 프로토콜의 중요한 단계는 변환 및 변환된 세포의 품질에 사용되는 세포의 품질에 의존합니다. 성공적인 트랜스퍼션을 위해 확인해야 하는 몇몇 세포 요구 사항은 세포 건강, 세포 은행 관리 및 세포가 미상 활성 상태에 있다는 것을 보장하고 있습니다. 또한, 트랜스듀스 된 세포의 생존가능성을 모니터링하는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SK, WR, QDL은 수의학 줄기세포 및 생명공학 연구단위인 라타다피섹톰포트 엔다우먼트 펀드, 출라롱콘대학교의 지원을 받았습니다. TO와 PP는2세기 프로젝트로 출라롱콘 학술 발전에 의해 지원되었다. CS는 수의학 학부의 보조금을 지원하는 연구에 의해 지원되었다, 출라롱콘 학술 발전 2세기 프로젝트, 수의학 줄기 세포 및 생명 공학 연구 단위, Ratchadaphiseksomphot 엔다우먼트 기금, 출라롱콘 대학, 정부 연구 기금.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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