Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC’s) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC’s).
Vanaf 2000 werd het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol voor de behandeling van diabetes mellitus type I nog steeds geconfronteerd met enkele obstakels. Deze omvatten het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren en het langdurig gebruik van immunosuppressiva. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) worden beschouwd als een potentiële kandidaat als een alternatieve bron van eilandjesachtige celgeneratie. Onze vorige rapporten hebben met succes de vaststelling van inductieprotocollen geïllustreerd voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC’s) tot insulineproducerende cellen (IPC’s). De inductie-efficiëntie varieerde echter sterk. In dit artikel demonstreren we de vergelijking van hDPSC’s pancreasinductie-efficiëntie via integratieve (micro-environmentale en genetische manipulatie) en niet-integratieve (micro-environmentale manipulatie) inductieprotocollen voor het leveren van hDPSC-afgeleide IPCs (hDPSC-IPCs). De resultaten suggereren een duidelijke inductie-efficiëntie voor zowel de inductiebenaderingen in termen van 3-dimensionale koloniestructuur, opbrengst, pancreas mRNA-markers en functionele eigenschap bij multidoseringsglucose-uitdaging. Deze bevindingen zullen de toekomstige oprichting van een klinisch toepasbaar IPCs- en pancreaslijnproductieplatform ondersteunen.
Diabetes mellitus is een voortdurende wereldwijde zorg. Een rapport van de International Diabetes Federation (IDF) schatte dat de wereldwijde prevalentie van diabetes zou toenemen van 151 miljoen in 2000 tot 415 miljoen in 20151,2. De meest recente epidemiologische studie heeft voorspeld dat de geschatte wereldwijde prevalentie van diabetes zal toenemen van 451 miljoen in 2017 tot 693 miljoen in 20451. Het succes van pancreas eilandjestransplantatie met behulp van het Edmonton-protocol werd voor het eerst aangetoond in 2000, toen werd aangetoond dat het de endogene insulineproductie handhaafde en de normoglycemische toestand stabiliseerde bij type I diabetespatiënten3. De toepassing van het Edmonton-protocol kampt echter nog steeds met een knelpuntprobleem. Het beperkte aantal cadaverische alvleesklierdonoren is het belangrijkste probleem, omdat elke patiënt met type I diabetes ten minste 2-4 eilandjesdonoren nodig heeft. Bovendien kan het langdurig gebruik van immunosuppressiva levensbedreigende bijwerkingen veroorzaken4,5. Om dit aan te pakken, heeft de ontwikkeling van een potentiële therapie voor diabetes in het afgelopen decennium zich voornamelijk gericht op de generatie van effectieve insulineproducerende cellen (IPC’s) uit verschillende bronnen van stamcellen6.
Stamcellen werden een alternatieve behandeling bij veel ziekten, waaronder diabetes type I, die wordt veroorzaakt door het verlies van bètacellen. Transplantatie van IPC’s is de nieuwe veelbelovende methode voor het beheersen van de bloedglucose bij deze patiënten7. In dit artikel worden twee benaderingen gepresenteerd voor het genereren van IPC’s, integratieve en niet-integratieve inductieprotocollen. Het inductieprotocol bootste het natuurlijke pancreasontwikkelingsproces na om de gerijpte en functionele IPC’s8,9te krijgen .
Voor deze studie werden hDPSC’s gekenmerkt door flowcytometrie voor MSC-oppervlaktemarkerdetectie, multilineagedifferentiatiepotentieel en RT-qPCR om de expressie van stamheidseigenschap en proliferatieve genmarkers te bepalen (gegevens niet getoond)8,9,10. hDPSC ‘s werden geïnduceerd in de richting van definitief endoderm, pancreasendoderm, pancreas-endocriene en pancreas bètacellen of IPC’s (figuur 1), respectievelijk7. Om de cellen te induceren, werd een inductiebenadering in drie stappen gebruikt als een backbone-protocol. Dit protocol werd een niet-integratief protocol genoemd. In het geval van integratief protocol werd de essentiële pancreastranscriptiefactor, PDX1, overexpressie in hDPSC’s gevolgd door de inductie van overexpressie PDX1 in hDPSC’s met behulp van een differentiatieprotocol in drie stappen. Het verschil tussen niet-integratief en integratief protocol is de overexpressie van PDX1 in het integratieve protocol en niet in het niet-integratieve protocol. De pancreasdifferentiatie werd in deze studie vergeleken tussen de integratieve en niet-integratieve protocollen.
Het bereiken van een hogere IPC-productie van MSC’s speelt een essentiële rol in diabetestherapie. De kritische stappen van het integratieve protocol zijn afhankelijk van de kwaliteit van cellen die moeten worden gebruikt voor de transductie en de kwaliteit van transducte cellen. Sommige celvereisten die moeten worden gecontroleerd op succesvolle transductie, zorgen voor celgezondheid, celbankbeheer en cellen bevinden zich in een mitotically actieve toestand. Verder speelt het monitoren van de levensvatbaarheid van tran…
The authors have nothing to disclose.
SK, WR en QDL werden ondersteund door de Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO en PP werden ondersteund door Chulalongkorn Academic Advancement in Its 2nd Century Project. CS werd ondersteund door een onderzoeksondersteunende subsidie van de Faculteit Diergeneeskunde, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University en Government Research Fund.
Cell Culture | |||
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
Three-step Induction Protocol | |||
Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |