इन विट्रो अग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम सेल का प्रेरण
Summary
यह प्रोटोकॉल विट्रो मेंअग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं (एचडीपीएससी) में अंतर करने के लिए दो अलग-अलग प्रेरण प्रोटोकॉलों के बीच तुलना प्रस्तुत करता है: एकीकृत प्रोटोकॉल और गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल। इंटीग्रेटिव प्रोटोकॉल अधिक इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) उत्पन्न करता है।
Abstract
2000 के रूप में, अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण की सफलता एडमोंटन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए प्रकार मैं मधुमेह मेलिटस के इलाज के लिए अभी भी कुछ बाधाओं का सामना करना पड़ा. इनमें शव अग्न्याशय दाताओं की सीमित संख्या और इम्यूनोसप्रेसेंट का दीर्घकालिक उपयोग शामिल है। मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) को आइलेट जैसे सेल जनरेशन के वैकल्पिक स्रोत के रूप में संभावित उम्मीदवार माना गया है । हमारी पिछली रिपोर्टों में इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) के लिए मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं (एचडीपीएससी) में अंतर करने के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल की स्थापना को सफलतापूर्वक दर्शाया गया है । हालांकि, प्रेरण दक्षता बहुत भिन्न थी। इस पेपर में, हम एचडीपीएससी-व्युत्पन्न आईपीसी (एचएसपीएससी-आईपीसी) देने के लिए एकीकृत (माइक्रोएनवायरमेंटल और जेनेटिक हेरफेर) और गैर-एकीकृत (माइक्रोएनवायरमेंटल हेरफेर) प्रेरण प्रोटोकॉल के माध्यम से एचडीपीएससी अग्नाशय की प्रेरण दक्षता की तुलना प्रदर्शित करते हैं। परिणाम बहु-खुराक ग्लूकोज चुनौती पर 3-आयामी कॉलोनी संरचना, उपज, अग्नाशय एमआरएनए मार्कर और कार्यात्मक संपत्ति के संदर्भ में दोनों प्रेरण दृष्टिकोणों के लिए अलग-अलग प्रेरण दक्षता का सुझाव देते हैं। ये निष्कर्ष चिकित्सकीय रूप से लागू आईपीसी और अग्नाशय वंश उत्पादन मंच की भावी स्थापना का समर्थन करेंगे।
Introduction
मधुमेह मेलिटस एक सतत वैश्विक चिंता का विषय है । इंटरनेशनल डायबिटीज फेडरेशन (आईडीएफ) की एक रिपोर्ट में अनुमान लगाया गया है कि मधुमेह की वैश्विक व्यापकता 2000 के 151 मिलियन से बढ़कर 2015 में 415 मिलियन हो जाएगी। नवीनतम महामारी विज्ञान आधारित अध्ययन में भविष्यवाणी की गई है कि दुनिया भर में मधुमेह की अनुमानित व्यापकता २०१७ में ४५१,०,००० से बढ़कर २०४५ १ में६९३,०,०हो जाएगी । एडमोंटन प्रोटोकॉल का उपयोग करके अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण की सफलता पहली बार 2000 में प्रदर्शित की गई थी, जब इसे अंतर्जात इंसुलिन उत्पादन को बनाए रखने और टाइप I मधुमेह रोगियों में नॉर्मोग्लिेमिक स्थिति को स्थिर करने के लिए दिखाया गया था3। हालांकि, एडमोंटन प्रोटोकॉल के आवेदन अभी भी एक अड़चन समस्या का सामना करना पड़ता है । कैडेनिक अग्न्याशय दाताओं की सीमित संख्या मुख्य मुद्दा है क्योंकि प्रकार के साथ प्रत्येक रोगी मैं मधुमेह कम से कम 2-4 आइलेट दाताओं की आवश्यकता है। इसके अलावा, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के दीर्घकालिक उपयोग से जीवन-धमकी देने वाले दुष्प्रभाव4,5 होसकतेहैं। इसका समाधान करने के लिए, पिछले एक दशक में मधुमेह के लिए एक संभावित चिकित्सा के विकास ने मुख्य रूप से स्टेम सेल 6 के विभिन्न स्रोतों से प्रभावीइंसुलिनउत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित किया है।
स्टेम सेल मधुमेह टाइप I सहित कई बीमारियों में एक वैकल्पिक उपचार बन गया, जो बीटा कोशिकाओं के नुकसान के कारण होता है। इन रोगियों में रक्त ग्लूकोज कोनियंत्रितकरने के लिए आईपीसी का प्रत्यारोपण नई आशाजनक विधि है । इस लेख में आईपीसी, इंटीग्रेटिव और नॉन-इंटीग्रेटिव इंडक्शन प्रोटोकॉल जेनरेट करने के लिए दो दृष्टिकोण प्रस्तुत किए गए हैं । इंडक्शन प्रोटोकॉल ने परिपक्व और कार्यात्मक आईपीसी8,9प्राप्त करने के लिए प्राकृतिक अग्नाशय की विकास प्रक्रिया की नकल की .
इस अध्ययन के लिए, एचडीपीएससी को एमएससी सतह मार्कर डिटेक्शन, मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता, और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए प्रवाह साइटोमेट्री की विशेषता थी, जो स्टेमनेस संपत्ति और प्रोलिफेरेटिव जीन मार्कर (डेटा नहीं दिखाए गए)8,9,10की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए था। एचडीपीएससी को क्रमशः7निश्चित एंडोडर्म, अग्नाशय के एंडोडर्म, अग्नाशय के अंतःस्रावी, और अग्नाशय बीटा-कोशिकाओं या आईपीसी(चित्रा 1)की ओर प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए, एक रीढ़ प्रोटोकॉल के रूप में एक तीन कदम प्रेरण दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल को नॉन इंटीग्रेटिव प्रोटोकॉल कहा जाता था। एकीकृत प्रोटोकॉल के मामले में, आवश्यक अग्नाशय के ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, पीडीएक्स 1को एचडीपीएससी में अतिउपसारित किया गया था जिसके बाद तीन चरणों वाले भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके एचडीपीएससी में अतिएक्सप्रेस्ड पीडीएक्स1 को शामिल किया गया था। गैर-एकीकृत और एकीकृत प्रोटोकॉल के बीच अंतर एकीकृत प्रोटोकॉल में पीडीएक्स 1 का अतिव्यवसंगतता है न कि गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल में। अग्नाशय के भेदभाव की तुलना इस अध्ययन में एकीकृत और गैर-एकीकृत प्रोटोकॉल के बीच की गई थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमएससी से उच्च आईपीसी उत्पादन प्राप्त करना मधुमेह चिकित्सा में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। एकीकृत प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ट्रांसडक्शन और ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं की गुणवत्ता के लिए उपयोग की जान?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसके, डब्ल्यूआर, और क्यूडीएल को वेटनरी स्टेम सेल और बायोइंजीनियरिंग रिसर्च यूनिट, राचडाफिसेकसोम्फॉट एंडोमेंट फंड, चुलालोंग्कोर्न विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। टू और पीपी को अपनी2 शताब्दी परियोजना में चुलालोंग्कोर्न अकादमिक उन्नति द्वारा समर्थित किया गया था। सीएस को पशु चिकित्सा विज्ञान संकाय, चुलालोंग्कोर्न अकादमिक उन्नति को अपनीदूसरी शताब्दी परियोजना, पशु चिकित्सा स्टेम सेल और बायोइंजीनियरिंग रिसर्च यूनिट, राचडाफिसेकसोम्फॉट एंडोमेंट फंड, चुलालोंग्कोर्न विश्वविद्यालय और सरकारी अनुसंधान निधि में एक शोध का समर्थन करने वाले शोध द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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