לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום
Summary
פרוטוקול זה מתאר מיצוי של תרכובות אורגניות נדיפות מדגימה ביולוגית בשיטת מיצוי סורבנט בסיוע ואקום, כרומטוגרפיית גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה באמצעות מסילת הכנת דגימות Entech וניתוח נתונים. הוא מתאר גם תרבית של דגימות ביולוגיות ובדיקת איזוטופים יציבה.
Abstract
לתרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) מדגימות ביולוגיות יש מקורות לא ידועים. תרכובות אורגניות נדיפות עשויות להגיע מהמארח או מאורגניזמים שונים מתוך הקהילה המיקרוביאלית של המארח. כדי לנטרל את מקורם של תרכובות אורגניות נדיפות, בוצעו ניתוח נדיף של תרביות חד-פרצופיות וקו-תרביות חיידקים של סטפילוקוקוס אאורוס, Pseudomonas aeruginosa ו-Acinetobacter baumannii, ובדיקת איזוטופים יציבים בדגימות ביולוגיות של צואה, רוק, ביוב וכיח. תרביות חד-פעמיות וקו-קו-תרביות שימשו לזיהוי ייצור נדיף ממיני חיידקים בודדים או בשילוב עם בדיקת איזוטופים יציבה כדי לזהות את חילוף החומרים הפעיל של מיקרובים מהדגימות הביולוגיות.
מיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) שימש לחילוץ תרכובות אורגניות נדיפות. VASE היא שיטת מיצוי מרחב ראש קלה לשימוש, ממוסחרת ונטולת ממסים עבור תרכובות נדיפות למחצה ונדיפות. המחסור בממסים ותנאי הכמעט ואקום המשמשים במהלך המיצוי הופכים את פיתוח השיטה לקל ומהיר יחסית בהשוואה לאפשרויות מיצוי אחרות כגון טרט-בוטילציה ומיקרו-אקסטרהקציה של פאזה מוצקה. זרימת העבודה המתוארת כאן שימשה לזיהוי חתימות נדיפות ספציפיות מתרבויות חד-צדדיות וקו-תרבויות. יתר על כן, ניתוח של בדיקת האיזוטופים היציבה של דגימות ביולוגיות הקשורות לבני אדם זיהה תרכובות אורגניות נדיפות שיוצרו באופן נפוץ או ייחודי. מאמר זה מציג את זרימת העבודה הכללית ואת השיקולים הניסיוניים של VASE בשילוב עם בדיקה איזוטופית יציבה של תרביות מיקרוביאליות חיות.
Introduction
לתרכובות אורגניות נדיפות (VOC) יש הבטחה גדולה לזיהוי וזיהוי של חיידקים מכיוון שהן נפלטות מכל האורגניזמים, ולמיקרובים שונים יש חתימות VOC ייחודיות. מולקולות נדיפות שימשו כמדידה לא פולשנית לאיתור זיהומים שונים בדרכי הנשימה, כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית1, שחפת2 בשתן3 ודלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה4, בנוסף להבחנה בין נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) לבין נבדקי ביקורת בריאים 5,6. חתימות נדיפות אפילו שימשו להבחנה בין זיהומים פתוגנים ספציפיים ב- CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9, ו– S. aureus לעומת P. aeruginosa10). עם זאת, עם המורכבות של דגימות ביולוגיות כאלה, לעתים קרובות קשה לאתר את המקור של תרכובות אורגניות נדיפות ספציפיות.
אסטרטגיה אחת לניתוק הפרופילים הנדיפים ממיקרובים מדביקים מרובים היא לבצע ניתוח מרחב ראש של מיקרואורגניזמים הן בתרבית מונו והן בתרבית משותפת11. ניתוח מרחב ראש בוחן את האנליטים הנפלטים לתוך “מרחב הראש” שמעל דגימה ולא את אלה המוטמעים במדגם עצמו. מטבוליטים מיקרוביאליים אופיינו לעתים קרובות בתרביות חד-תרבותיות בגלל הקושי לקבוע את מקורם של מטבוליטים מיקרוביאליים בדגימות קליניות מורכבות. על-ידי יצירת פרופילים של נדיפים מתרביות חד-תרביות של חיידקים, סוגי הנדיפים שמייצר מיקרוב במבחנה עשויים לייצג בסיס ברפרטואר הנדיף שלו. שילוב של תרביות חיידקים, למשל, יצירת תרביות משותפות ויצירת פרופיל של המולקולות הנדיפות המיוצרות עשוי לחשוף את האינטראקציות או ההזנה הצולבת בין החיידקים12.
אסטרטגיה נוספת לזיהוי המקור המיקרוביאלי של מולקולות נדיפות היא לספק מקור תזונתי המסומן באיזוטופ יציב. איזוטופים יציבים הם צורות טבעיות ולא רדיואקטיביות של אטומים עם מספר שונה של נויטרונים. באסטרטגיה שנעשה בה שימוש מאז תחילת שנות ה-30 של המאה ה-20 כדי להתחקות אחר חילוף חומרים פעיל בבעלי חייםבני 13, המיקרואורגניזם ניזון ממקור ההזנה המסומן ומשלב את האיזוטופ היציב במסלולים המטבוליים שלו. לאחרונה, איזוטופ יציב בצורה של מים כבדים (D2O) שימש לזיהוי S. aureus פעיל מטבולית בדגימת כיח קלינית CF14. בדוגמה אחרת, 13גלוקוז עם תווית C שימש להדגמת האכלה צולבת של מטבוליטים בין מבודדים קליניים של CF של P. aeruginosa ו Rothia mucilaginosa12 .
עם התקדמותן של טכניקות ספקטרומטריית מסות, שיטות לאיתור רמזים נדיפים עברו מתצפיות איכותיות למדידות כמותיות יותר. על ידי שימוש בספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז (GC-MS), עיבוד דגימות ביולוגיות הפך להיות בהישג יד עבור רוב ההגדרות המעבדתיות או הקליניות. שיטות רבות לסקר מולקולות נדיפות שימשו לפרופיל דגימות כגון מזון, תרביות חיידקים ודגימות ביולוגיות אחרות, ואוויר ומים לאיתור זיהום. עם זאת, מספר שיטות נפוצות של דגימה נדיפה עם תפוקה גבוהה דורשות ממס ואינן מבוצעות עם היתרונות המסופקים על ידי מיצוי ואקום. בנוסף, נפחים או כמויות גדולים יותר (מעל 0.5 מ”ל) של חומרים שנדגמו נדרשים לעתים קרובות לניתוח 15,16,17,17,18,19, אם כי זה ספציפי למצע ודורש אופטימיזציה עבור כל סוג מדגם ושיטה.
כאן, נעשה שימוש במיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) ולאחר מכן בספיגה תרמית ב-GC-MS כדי לסקור את הפרופילים הנדיפים של תרביות חד-תאיות חיידקיות ו-co-co ולזהות נדיפים המיוצרים באופן פעיל עם איזוטופים יציבים הנבדקים מצואה אנושית, רוק, ביוב ודגימות כיח (איור 1). עם כמויות דגימה מוגבלות, תרכובות אורגניות נדיפות הוצאו מתוך 15 μL בלבד של כיח. ניסויי בדיקת איזוטופים עם דגימות אנושיות דרשו הוספת מקור איזוטופי יציב, כגון גלוקוז 13C, ומדיה לטיפוח הצמיחה של הקהילה המיקרוביאלית. הייצור הפעיל של נדיפים זוהה כמולקולה כבדה יותר על ידי GC-MS. מיצוי של מולקולות נדיפות תחת ואקום סטטי אפשר זיהוי של מולקולות נדיפות עם רגישות מוגברת 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לזהות ייצור נדיף בתרביות חוץ גופיות ובדגימות הקשורות לבני אדם, בוצע ניתוח נדיף של תרבויות מונו וקו-קו של P. aeruginosa, S. aureus ו- A. baumanii ובדיקת איזוטופים יציבה של דגימות ביולוגיות שונות. בניתוח עבור התרביות המונו-ותרביות המשותף, נדיפים זוהו על ידי ביצוע מיצוי קצר במשך שעה אחת ב-70 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להת’ר מוהן ולינדה מ. קאליקין על העריכה הקפדנית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI (מענק 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
