真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉
Summary
このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。
Abstract
生体試料由来の揮発性有機化合物(VOC)は起源不明です。VOCは、宿主または宿主の微生物群集内からの異なる生物に由来する可能性がある。微生物VOCの起源を解きほぐすために、 黄色ブドウ球菌、緑膿菌 、および アシネトバクター・バウマンニの細菌単培養および共培養物の揮発性ヘッドスペース分析、ならびに糞便、唾液、下水、および痰の生物学的サンプルにおける安定同位体プロービングが行われた。単一培養および共培養物を使用して、個々の細菌種からの揮発性産生を同定するか、または安定同位体プロービングと組み合わせて、生物学的サンプルからの微生物の活性代謝を同定した。
VOCsを抽出するために真空支援吸着剤抽出(VASE)が用いられた。VASEは、半揮発性および揮発性化合物用の使いやすく、商業化された無溶媒ヘッドスペース抽出法です。抽出時に使用される溶媒の不足および真空に近い条件により、 tert-ブチル化および固相マイクロ抽出などの他の抽出オプションと比較して、方法の開発が比較的容易かつ迅速に行われる。ここで説明するワークフローは、単一および共同カルチャからの特定の揮発性シグネチャを識別するために使用されました。さらに、ヒト関連生物試料の安定同位体プロービングの分析により、一般的または一意に産生されたVOCが同定された。本稿では、VASEの一般的なワークフローと実験的考察を、生きた微生物培養物の安定同位体プロービングと併せて提示する。
Introduction
揮発性有機化合物(VOC)は、すべての生物から放出され、異なる微生物が固有のVOCシグネチャを有するため、細菌の検出と同定に大きな期待を寄せています。揮発性分子は、嚢胞性線維症(CF)を有する被験者と健常対照者5,6を区別することに加えて、慢性閉塞性肺疾患1、尿中結核2、人工呼吸器関連肺炎4を含む様々な呼吸器感染症を検出するための非侵襲的測定として利用されている。揮発性シグネチャは、CFにおける特定の病原体感染(黄色ブドウ球菌7、緑膿菌8、9、および黄色ブドウ球菌対緑膿菌10)を区別するためにも使用されている。 しかし、このような生物学的サンプルの複雑さにより、特定のVOCの発生源を特定することはしばしば困難である。
複数の感染微生物から揮発性プロファイルを解きほぐすための1つの戦略は、単一培養および共培養11の両方において微生物のヘッドスペース分析を行うことである。ヘッドスペース分析は、サンプル自体に埋め込まれた分析物ではなく、サンプルの上の「ヘッドスペース」に放出される分析種を調べます。微生物代謝産物は、複雑な臨床サンプル中の微生物代謝産物の起源を決定することが困難であるため、単一培養においてしばしば特徴付けられてきた。細菌単一培養物から揮発性物質をプロファイリングすることにより、微生物が インビトロで 産生する揮発性物質の種類は、その揮発性レパトアのベースラインを表し得る。細菌培養物を組み合わせること、 例えば、共培養物を作成し、産生される揮発性分子をプロファイリングすることは、細菌12間の相互作用または交配を明らかにし得る。
揮発性分子の微生物起源を同定するための別の戦略は、安定同位体で標識された栄養源を提供することである。安定同位体は、中性子の数が異なる天然に存在する非放射性の原子です。動物13の活性代謝を追跡するために1930年代初頭から利用されてきた戦略では、微生物は標識された栄養源から摂食し、安定同位体を代謝経路に組み込んでいる。より最近では、重水(D2O)の形態の安定同位体が、臨床CF喀痰試料14において代謝的に活性な黄色ブドウ球菌を同定するために使用されている。別の例では、13C標識グルコースが、緑膿菌のCF臨床分離株とRothia mucilaginosaとの間の代謝産物の交差摂食を実証するために用いられている12。
質量分析技術の進歩に伴い、揮発性の手がかりを検出する方法は、定性的な観察からより定量的な測定に移行しました。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用することにより、生物学的サンプルの処理は、ほとんどの実験室または臨床現場で手の届くところにあります。揮発性分子を調査する多くの方法は、汚染を検出するために、食品、細菌培養物、およびその他の生物学的サンプル、および空気および水などのサンプルをプロファイルするために使用されてきた。しかし、ハイスループットで揮発性サンプリングを行ういくつかの一般的な方法は、溶媒を必要とし、真空抽出によって提供される利点では実行されません。さらに、分析には、より大きな量または量(0.5mLを超える)のサンプリングされた材料がしばしば必要とされますが、これは基質固有であり、サンプルタイプおよび方法ごとに最適化する必要があります。
ここでは、真空支援吸着剤抽出(VASE)とそれに続くGC-MSでの熱脱着を用いて、細菌の単一培養物および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した(図1)。限られたサンプル量で、VOCはわずか15μLの喀痰から抽出されました。ヒト試料を用いた同位体プロービング実験では、微生物群集の増殖を培養するために、13Cグルコースなどの安定同位体源と培地を添加する必要があった。揮発分の活性産生は、GC−MSによってより重い分子として同定された。静的真空下での揮発性分子の抽出により、揮発性分子の検出が感度が向上しました20,21,22。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロ培養物およびヒト関連サンプルにおける揮発性産生を同定するために、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、およびA.バウマニイの単一および共培養物の揮発性分析、ならびに異なる生物学的サンプルの安定同位体プロービングが行われた。モノ培養および共培養についての分析において、揮発分は、70°Cで1時間の短い抽出を行うことにより検出された。 単一および共培?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ヘザー・モーガンとリンダ・M・カリキンに、この原稿を慎重に編集してくれたことに感謝します。この研究はNIH NHLBIの支援を受けた(助成金5R01HL136647-04)。
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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