Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента
Summary
Этот протокол описывает извлечение летучих органических соединений из биологического образца методом вакуумной экстракции сорбента, газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией с использованием Entech Sample Preparation Rail и анализ данных. Он также описывает культуру биологических образцов и зондирование стабильных изотопов.
Abstract
Летучие органические соединения (ЛОС) из биологических образцов имеют неизвестное происхождение. ЛОС могут происходить от хозяина или различных организмов из микробного сообщества хозяина. Чтобы распутать происхождение микробных ЛОС, был проведен анализ летучих головных пространств бактериальных моно- и кокультур золотистого стафилококка, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, а также исследование стабильных изотопов в биологических образцах кала, слюны, сточных вод и мокроты. Моно- и кокультуры использовались для идентификации летучего производства из отдельных видов бактерий или в сочетании со стабильным изотопным зондированием для идентификации активного метаболизма микробов из биологических образцов.
Для извлечения ЛОС использовалась вакуумная экстракция сорбента (VASE). VASE – это простой в использовании, коммерциализированный, не содержащий растворителей метод экстракции из пространства над головой для полулетучих и летучих соединений. Отсутствие растворителей и почти вакуумные условия, используемые во время экстракции, делают разработку метода относительно легкой и быстрой по сравнению с другими вариантами экстракции, такими как трет-бутилирование и твердофазная микроэкстракция. Описанный здесь рабочий процесс использовался для идентификации конкретных изменчивых сигнатур из моно- и сокультур. Кроме того, анализ зондирования стабильных изотопов связанных с человеком биологических образцов выявил ЛОС, которые либо обычно, либо уникально производились. В данной статье представлен общий рабочий процесс и экспериментальные соображения VASE в сочетании со стабильным изотопным зондированием живых микробных культур.
Introduction
Летучие органические соединения (ЛОС) имеют большие перспективы для обнаружения и идентификации бактерий, поскольку они выделяются всеми организмами, а различные микробы имеют уникальные сигнатуры ЛОС. Летучие молекулы использовались в качестве неинвазивного измерения для выявления различных респираторных инфекций, включая хроническую обструктивную болезнь легких1, туберкулез2 в моче3 и пневмонию, связанную с ИВЛ4, в дополнение к различению субъектов с муковисцидозом (МВ) от здоровых контрольных субъектов 5,6. Летучие сигнатуры даже использовались для различения специфических патогенных инфекций при муковисцидозе (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 и S. aureus vs. P. aeruginosa10). Однако из-за сложности таких биологических образцов часто бывает трудно точно определить источник конкретных ЛОС.
Одной из стратегий отделения летучих профилей от множественных инфекционных микробов является проведение анализа пространства над головой микроорганизмов как в моно-, так и в кокультуре11. Анализ пространства над головой исследует аналиты, испускаемые в «пространство головы» над образцом, а не те, которые встроены в сам образец. Микробные метаболиты часто характеризуются в монокультурах из-за сложности определения происхождения микробных метаболитов в сложных клинических образцах. Профилируя летучие вещества из бактериальных монокультур, типы летучих веществ, которые микроб производит in vitro , могут представлять собой базовую линию его летучего репертуара. Объединение бактериальных культур, например, создание кокультур и профилирование образующихся летучих молекул может выявить взаимодействия или перекрестное питание между бактериями12.
Другая стратегия идентификации микробного происхождения летучих молекул заключается в обеспечении источника питательных веществ, который помечен стабильным изотопом. Стабильные изотопы являются естественными, нерадиоактивными формами атомов с различным количеством нейтронов. В стратегии, которая использовалась с начала 1930-х годов для отслеживания активного метаболизма у животных13, микроорганизм питается от меченого источника питательных веществ и включает стабильный изотоп в свои метаболические пути. Совсем недавно стабильный изотоп в виде тяжелой воды (D2O) был использован для идентификации метаболически активного S. aureus в клиническом образце мокротыCF 14. В другом примере 13С-меченая глюкоза была использована для демонстрации перекрестного питания метаболитов между клиническими изолятами МВ P. aeruginosa и Rothia mucilaginosa12 .
С развитием методов масс-спектрометрии методы обнаружения летучих сигналов перешли от качественных наблюдений к более количественным измерениям. Используя масс-спектрометрию газовой хроматографии (GC-MS), обработка биологических образцов стала доступной для большинства лабораторных или клинических условий. Многие методы исследования летучих молекул использовались для профилирования образцов, таких как пищевые продукты, бактериальные культуры и другие биологические образцы, а также воздуха и воды для обнаружения загрязнения. Однако некоторые распространенные методы летучего отбора проб с высокой пропускной способностью требуют растворителя и не выполняются с преимуществами, предоставляемыми вакуумной экстракцией. Кроме того, для анализа 15,16,17,18,19 часто требуются большие объемы или количества (более 0,5 мл) отобранных материалов, хотя это специфично для субстрата и требует оптимизации для каждого типа образца и метода.
Здесь вакуумная экстракция сорбента (VASE) с последующей термической десорбцией на GC-MS использовалась для обследования летучих профилей бактериальных моно- и кокультур и выявления активно продуцируемых летучих веществ со стабильным изотопным зондированием из образцов фекалий человека, слюны, сточных вод и мокроты (рисунок 1). При ограниченных количествах образцов ЛОС извлекали всего из 15 мкл мокроты. Эксперименты по изотопному зондированию с образцами человека требовали добавления стабильного изотопного источника, такого как глюкоза 13° C, и среды для культивирования роста микробного сообщества. Активное производство летучих веществ было идентифицировано как более тяжелая молекула GC-MS. Экстракция летучих молекул в статическом вакууме позволила обнаружить летучие молекулы с повышенной чувствительностью 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для выявления летучего производства в культурах in vitro и связанных с человеком образцах был проведен летучий анализ моно- и кокультур P. aeruginosa, S. aureus и A. baumanii и стабильное изотопное зондирование различных биологических образцов. В анализе для моно- и ко-культур летучие вещес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Хизер Моэн и Линду М. Каликин за тщательное редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH NHLBI (грант 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
