Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío
Summary
Este protocolo describe la extracción de compuestos orgánicos volátiles de una muestra biológica con el método de extracción de sorbente asistido por vacío, cromatografía de gases junto con espectrometría de masas utilizando el riel de preparación de muestras Entech y análisis de datos. También describe el cultivo de muestras biológicas y el sondeo de isótopos estables.
Abstract
Los compuestos orgánicos volátiles (COV) de muestras biológicas tienen orígenes desconocidos. Los COV pueden originarse en el huésped o en diferentes organismos dentro de la comunidad microbiana del huésped. Para desentrañar el origen de los COV microbianos, se realizó un análisis volátil del espacio de cabeza de mono y cocultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii, y sondeo de isótopos estables en muestras biológicas de heces, saliva, aguas residuales y esputo. Se utilizaron monocultivos y cocultivos para identificar la producción volátil de especies bacterianas individuales o en combinación con sondeos de isótopos estables para identificar el metabolismo activo de los microbios a partir de las muestras biológicas.
Se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) para extraer los COV. VASE es un método de extracción de espacio de cabeza fácil de usar, comercializado y sin disolventes para compuestos semivolátiles y volátiles. La falta de disolventes y las condiciones cercanas al vacío utilizadas durante la extracción hacen que el desarrollo de un método sea relativamente fácil y rápido en comparación con otras opciones de extracción, como la terc-butilación y la microextracción en fase sólida. El flujo de trabajo descrito aquí se utilizó para identificar firmas volátiles específicas de monocultivos y cocultivos. Además, el análisis del sondeo de isótopos estables de muestras biológicas humanas asociadas identificó COV que se produjeron de forma común o única. Este artículo presenta el flujo de trabajo general y las consideraciones experimentales de VASE junto con el sondeo de isótopos estables de cultivos microbianos vivos.
Introduction
Los compuestos orgánicos volátiles (COV) son muy prometedores para la detección e identificación de bacterias porque son emitidos por todos los organismos, y los diferentes microbios tienen firmas únicas de COV. Las moléculas volátiles se han utilizado como una medida no invasiva para detectar diversas infecciones respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica1, la tuberculosis2 en la orina3 y la neumonía asociada al ventilador4, además de distinguir a los sujetos con fibrosis quística (FQ) de los sujetos de control sanos 5,6. Las firmas volátiles incluso se han utilizado para distinguir infecciones patógenas específicas en la FQ (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 y S. aureus vs. P. aeruginosa10). Sin embargo, con la complejidad de tales muestras biológicas, a menudo es difícil identificar la fuente de COV específicos.
Una estrategia para desenredar los perfiles volátiles de múltiples microbios infecciosos es realizar análisis del espacio de cabeza de los microorganismos tanto en monocultivo como en cocultivo11. El análisis del espacio de cabeza examina los analitos emitidos en el “espacio de cabeza” sobre una muestra en lugar de los incrustados en la muestra misma. Los metabolitos microbianos a menudo se han caracterizado en monocultivos debido a la dificultad para determinar el origen de los metabolitos microbianos en muestras clínicas complejas. Al perfilar volátiles a partir de monocultivos bacterianos, los tipos de volátiles que un microbio produce in vitro pueden representar una línea de base de su repertorio volátil. La combinación de cultivos bacterianos, por ejemplo, la creación de cocultivos y el perfil de las moléculas volátiles producidas pueden revelar las interacciones o la alimentación cruzada entre las bacterias12.
Otra estrategia para identificar el origen microbiano de las moléculas volátiles es proporcionar una fuente de nutrientes que esté etiquetada con un isótopo estable. Los isótopos estables son formas naturales y no radiactivas de átomos con un número diferente de neutrones. En una estrategia que se ha utilizado desde principios de la década de 1930 para rastrear el metabolismo activo en animales13, el microorganismo se alimenta de la fuente de nutrientes etiquetada e incorpora el isótopo estable en sus vías metabólicas. Más recientemente, se ha utilizado un isótopo estable en forma de agua pesada (D2O) para identificar S. aureus metabólicamente activo en una muestra clínica de esputo de FQ14. En otro ejemplo, se ha utilizado 13glucosa marcada con C para demostrar la alimentación cruzada de metabolitos entre aislados clínicos de FQ de P. aeruginosa y Rothia mucilaginosa12 .
Con el avance de las técnicas de espectrometría de masas, los métodos de detección de señales volátiles han pasado de observaciones cualitativas a mediciones más cuantitativas. Mediante el uso de la espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), el procesamiento de muestras biológicas se ha vuelto al alcance de la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio. Se han utilizado muchos métodos para estudiar moléculas volátiles para perfilar muestras como alimentos, cultivos bacterianos y otras muestras biológicas, y aire y agua para detectar la contaminación. Sin embargo, varios métodos comunes de muestreo volátil con alto rendimiento requieren disolvente y no se realizan con las ventajas proporcionadas por la extracción al vacío. Además, a menudo se requieren volúmenes o cantidades mayores (superiores a 0,5 ml) de materiales muestreados parael análisis 15,16,17,18,19, aunque esto es específico del sustrato y requiere optimización para cada tipo de muestra y método.
Aquí, se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) seguida de la desorción térmica en un GC-MS para estudiar los perfiles volátiles de monocultivos y cocultivos bacterianos e identificar volátiles producidos activamente con sondeo de isótopos estables a partir de heces humanas, saliva, aguas residuales y muestras de esputo (Figura 1). Con cantidades de muestra limitadas, los COV se extrajeron de tan solo 15 μL de esputo. Los experimentos de sondeo de isótopos con muestras humanas requirieron agregar una fuente de isótopos estable, como glucosa de 13C, y medios para cultivar el crecimiento de la comunidad microbiana. La producción activa de volátiles fue identificada como una molécula más pesada por GC-MS. La extracción de moléculas volátiles bajo vacío estático permitió la detección de moléculas volátiles con mayor sensibilidad 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para identificar la producción volátil en cultivos in vitro y muestras asociadas al ser humano, se realizó un análisis volátil de monocultivos y cocultivos de P. aeruginosa, S. aureus y A. baumanii y sondeo de isótopos estables de diferentes muestras biológicas. En el análisis para los monocultivos y cocultivos, se detectaron volátiles realizando una extracción corta durante 1 h a 70 °C. El análisis volátil de monocultivos y cocultivos permitió el estudio de los compuestos produc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Heather Maughan y Linda M. Kalikin por la cuidadosa edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH NHLBI (subvención 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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