진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획
Summary
이 프로토콜은 진공 보조 흡착제 추출 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 화합물을 추출하는 방법, Entech 샘플 준비 레일을 사용한 질량 분광법과 결합 된 가스 크로마토그래피 및 데이터 분석을 설명합니다. 또한 생물학적 샘플 및 안정한 동위원소 프로빙의 배양을 기술한다.
Abstract
생물학적 샘플로부터의 휘발성 유기 화합물(VOC)은 기원을 알 수 없다. VOCs는 숙주의 미생물 군집 내에서 숙주 또는 상이한 유기체로부터 기원할 수 있다. 미생물 VOCs의 기원을 분리하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 aeruginosa , 및 Acinetobacter baumannii의 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 헤드 스페이스 분석, 및 배설물, 타액, 하수 및 객담의 생물학적 샘플에서 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물을 사용하여 개별 박테리아 종으로부터의 휘발성 생산을 확인하거나 생물학적 샘플로부터 미생물의 활성 대사를 확인하기 위해 안정한 동위원소 프로빙과 조합하였다.
진공-보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 VOCs를 추출하였다. VASE는 반휘발성 및 휘발성 화합물에 대한 사용하기 쉽고 상용화되고 무용제 헤드스페이스 추출 방법입니다. 추출 중에 사용되는 용매의 부족과 거의 진공 조건은 tert-butylation 및 고상 미세 추출과 같은 다른 추출 옵션과 비교할 때 상대적으로 쉽고 빠른 방법을 개발할 수있게합니다. 여기에 설명된 워크플로는 모노 및 공동 문화권의 특정 휘발성 서명을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 인간 관련 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙의 분석은 일반적으로 또는 고유하게 생산되는 VOC를 확인했다. 이 백서는 살아있는 미생물 배양물의 안정적인 동위원소 조사와 함께 ASE의 일반적인 워크 플로우 및 실험 고려 사항을 제시합니다.
Introduction
휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 모든 유기체에서 방출되기 때문에 박테리아 검출 및 식별에 큰 약속을 가지고 있으며, 다른 미생물은 고유 한 VOC 서명을 가지고 있습니다. 휘발성 분자는 만성 폐쇄성 폐 질환1, 소변3의 결핵2, 인공호흡기 관련 폐렴4를 포함한 다양한 호흡기 감염을 검출하기 위한 비침습적 측정으로서 활용되었으며, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 피험자를 건강한 대조군 피험자(5,6)와 구별하는 것 이외에 활용되었다. 휘발성 서명은 심지어 CF에서 특정 병원체 감염을 구별하기 위해 사용되었다 (스타필로코커스 아우레우스 7, 슈도모나스 aeruginosa 8,9, 및 S. 아우레우스 대 P. aeruginosa10). 그러나, 이러한 생물학적 샘플의 복잡성으로 인해, 특정 VOC의 공급원을 정확히 찾아내는 것은 종종 어렵다.
다수의 감염 미생물로부터 휘발성 프로파일을 분리하기 위한 하나의 전략은 모노- 및 공동-배양11 둘 다에서 미생물의 헤드스페이스 분석을 수행하는 것이다. 헤드스페이스 분석은 샘플 자체에 포함된 분석물이 아닌 샘플 위의 “헤드스페이스”로 방출되는 분석물을 검사합니다. 미생물 대사 산물은 종종 복잡한 임상 샘플에서 미생물 대사 산물의 기원을 결정하는 데 어려움이 있기 때문에 단일 배양에서 특성화되었습니다. 박테리아 모노 배양물로부터의 휘발성 물질을 프로파일링함으로써, 미생물이 시험관내에서 생성하는 휘발성 물질의 유형은 그의 휘발성 레퍼토리의 기준선을 나타낼 수 있다. 박테리아 배양물을 결합, 예를 들어, 공동 배양물을 생성하고, 생성된 휘발성 분자를 프로파일링하는 것은 박테리아(12) 사이의 상호작용 또는 교차-공급을 나타낼 수 있다.
휘발성 분자의 미생물 기원을 확인하기 위한 또 다른 전략은 안정한 동위원소로 표지되는 영양 공급원을 제공하는 것이다. 안정한 동위원소는 자연적으로 발생하며, 중성자의 수가 다른 원자의 비방사성 형태이다. 1930년대 초부터 동물(13)의 활성 대사를 추적하기 위해 활용되어 온 전략에서, 미생물은 라벨이 붙은 영양원을 떼어내고 안정적인 동위원소를 대사 경로에 통합한다. 보다 최근에, 중수 형태의 안정한 동위원소 (D2O)가 임상 CF 객담 샘플14에서 대사적으로 활성인 S. 아우레우스를 확인하기 위해 사용되었다. 또 다른 예에서, 13C표지된 글루코스는 P. aeruginosa와 Rothia mucilaginosa12의 CF 임상 단리물 사이의 대사산물의 교차 공급을 입증하는데 사용되었다.
질량 분광법 기술의 발전과 함께, 휘발성 신호를 검출하는 방법은 질적 관찰에서 더 정량적 측정으로 옮겨갔습니다. 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용함으로써 생물학적 샘플의 처리는 대부분의 실험실 또는 임상 환경에서 도달 할 수있게되었습니다. 휘발성 분자를 조사하기 위한 많은 방법들이 오염을 검출하기 위해 식품, 박테리아 배양물, 및 다른 생물학적 샘플, 및 공기 및 물과 같은 샘플을 프로파일링하는데 사용되어 왔다. 그러나, 높은 처리량을 갖는 휘발성 샘플링의 몇몇 일반적인 방법은 용매를 필요로 하며, 진공 추출에 의해 제공되는 이점으로 수행되지 않는다. 또한 분석 15,16,17,18,19에 더 많은 부피 또는 양(0.5mL 초과)의 샘플링된 물질이 필요한 경우가 많지만, 이는 기판에 따라 다르며 각 샘플 유형 및 방법에 대한 최적화가 필요합니다.
여기서, GC-MS 상에서 열 탈착에 이어 진공 보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 박테리아 모노 및 공동 배양물의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 갖는 활발하게 생성된 휘발성 물질을 확인했다(도 1). 제한된 샘플 수량으로, VOCs는 가래의 최소 15 μL에서 추출되었다. 인간 샘플을 이용한 동위원소 프로빙 실험은 미생물 군집의 성장을 육성하기 위해 13C글루코스와 같은 안정한 동위원소 공급원 및 배지를 첨가하는 것이 필요했습니다. 휘발성 물질의 활성 생산은 GC-MS에 의해 더 무거운 분자로 확인되었다. 정적 진공 하에서 휘발성 분자를 추출하면 감도가 증가한 휘발성 분자를 검출할 수 있었습니다20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
시험관내 배양 및 인간 관련 샘플에서의 휘발성 생산을 확인하기 위해, P. aeruginosa, S. aureus 및 A. baumanii의 모노- 및 공동 배양물의 휘발성 분석 및 상이한 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물에 대한 분석에서, 휘발성 물질은 70°C에서 1시간 동안 짧은 추출을 수행하여 검출되었다. 모노 및 공동 배양의 휘발성 분석은 개별 종에 의해 그?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고를 신중하게 편집해 주신 Heather Maughan과 Linda M. Kalikin에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH NHLBI (보조금 5R01HL136647-04)가 지원했습니다.
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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