Summary
展示的是一种计算工具，允许从2D荧光图像中简单直接地自动测量神经元树突分支的方向。
Abstract
神经元树突树的结构在神经元中突触输入的整合中起着关键作用。因此，树突形态的表征对于更好地了解神经元功能至关重要。然而，树突树的复杂性，无论是孤立的还是位于神经元网络内时，都尚未完全理解。我们开发了一种新的计算工具 SOA （分割和定向分析），它允许从2D神经元培养物的荧光图像中自动测量树突分支的方向。用Python编写的SOA使用分割来区分树突分支和图像背景，并在每个分支的空间方向上积累一个数据库。然后，该数据库用于计算形态参数，例如网络中树突分支的方向分布和平行树突分支生长的流行率。获得的数据可用于检测树突的结构变化，以响应神经元活动以及生物和药理学刺激。
Introduction
树突形态发生是神经科学的核心主题，因为树突树的结构会影响神经元突触整合的计算特性1，2，3。此外，树突状支的形态异常和修饰与退行性和神经发育障碍有关4，5，6。在树突状分支更容易可视化的神经元培养物中，非姐妹树突状分支之间的相互作用调节沿分支突触聚集的部位和程度，这种行为可能会影响突触共性和可塑性7，8，9。因此，使用二维（2D）神经元培养物表征树突状树的形态参数有利于了解树突形态发生和单个神经元和神经网络的功能。然而，这是一项具有挑战性的任务，因为即使在"简化"的2D神经元培养物中，树突状分支也会形成复杂的网格。
已经开发了几种工具来自动跟踪和分析树突结构10，11，12，13。但是，这些工具中的大多数都是为3D神经元网络设计的，并且自然太复杂而无法与2D网络一起使用。相比之下，不太先进的形态分析工具通常涉及计算机辅助体力劳动的重要组成部分，这非常耗时且容易受到操作员偏差的影响14。现有的半自动工具，如'ImageJ'15 （NIH开源图像处理软件包，其中包含大量社区开发的生物图像分析工具），大大减少了用户的体力劳动。然而，在图像处理过程中仍然需要一些人工干预，并且分割的质量可能低于预期。
本文介绍了SOA，这是一个简单的自动化工具，允许对2D神经元网络中的树突分支进行直接分割和定向分析。SOA可以检测2D图像中的各种线状物体，并表征它们的形态特性。在这里，我们使用SOA对培养物中树突网络的2D荧光图像中的树突分支进行分段。该软件识别树突分支，并成功执行形态参数的测量，如平行度和空间分布。SOA可以很容易地用于分析其他细胞类型的细胞过程和研究非生物网络。
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Protocol
注意：以色列卫生部批准根据协议IL-218-01-21使用小鼠用于实验动物的道德使用。SOA仅与Windows 10和Python 3.9兼容。它以开源代码的形式提供：https://github.com/inbar2748/DendriteProject。在此链接中，还有一个自述文件。DM 文件，其中包含软件下载说明、软件网站的链接以及包含所有软件包所需版本信息的要求文件。那里还提供了使用该软件执行的分析的其他示例。
图 1：用于细分和增长方向分析的 SOA 工作流。 图中显示了树突状网络荧光图像的处理步骤和数据分析。上传二维图像，进行分割（分两步进行：将树突状支线检测为线，然后将相关线合并），并获得每个树突支的空间信息。收集图像中所有树突分支的数据。最后，分析数据以提供所需的形态参数。缩写：SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 打开 SOA 应用程序。
- 打开URL地址：https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA，找到 SOA.zip 压缩文件夹，然后双击下载ZIP文件。
- 通过右键单击 SOA 解压缩文件夹.zip然后选择" 解压缩文件"。 观察打开的 "提取路径和选项" 窗口以及显示提取文件路径的" 目标地址 "文本框。要解压缩到其他位置，请单击窗口右侧面板中的某个文件夹，使其成为目标文件夹。单击 "确定"将文件解压缩到该文件夹。
- 打开提取的 SOA 文件，然后双击 SOA.exe。 等待黑色窗口打开，之后将出现应用程序。
图 2：使用 SOA 的 GUI 的工作流示例。 左列：工作流的 GUI 部分。中间列：在工作流程中处理的树枝状网络的图像（比例尺：20μm）。右列：放大中间列图像中由红色矩形标记的区域（比例尺：4μm）。步骤1：选择并上传图像。步骤2：分割的第一阶段是检测代表已识别树突分支的线。第3步：分割的第二阶段是基于接近的单个树突分支中段衬里的合并。可以修改所有步骤的设置。缩写：SOA = 分割和方向分析;GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 打开要分析的图像。
- 在 SOA 查看器上载 菜单栏中|选择 "选择文件|从计算机文件中选择图像|单击它（仅.png .jpg .tif .bmp文件）| 打开 |观察文件|的路径 下一个。
3. 细分优化
注意：在 SOA 查看器属性 菜单栏中，更改所选参数的值以调整分段过程设置。参数（如 阈值）的详细说明在 补充材料中给出。
- 在 "边缘"中，通过选择" 阈值"并输入一个数字来调整显示的阈值。
注意：阈值的数字越低，检测到的行数就越多。阈值是介于 0 到 255 之间的数字。默认值已设置为 0。 - 在 合并行中：
- 通过选择要合并的最小距离并输入一个数字 来调整要合并 的显示的最小距离。
注意：合并 的最小距离 范围为 0 到 30 像素。默认值设置为 20。 - 通过选择要合并的最小角度并输入一个数字 ，调整要合并 的显示的最小角度。
注： 要合并的最小角度 范围为 0 到 30°。默认值设置为 10。
- 通过选择要合并的最小距离并输入一个数字 来调整要合并 的显示的最小距离。
- 单击 "创建预览分割图像"。
注意：将根据更新的值显示分割结果的预览图像。此外，将显示合并前的行数和合并后的行数。 - 更改参数以实现段的最大识别。如果需要更改属性，请单击" 关闭"窗口 按钮，然后按照步骤 3.1-3.4 进行操作。
4. 创建输出文件。
- 按 OK 可可视化分割图像和分析图形。观察出现的窗口，以选择要保存.xlsx文件的位置。
- 插入文件名|选择 保存 |等待创建并保存包含数据的.xlsx文件。
注意：除了.xlsx文件外，还会自动显示以下文件：显示原始图像的文件、线识别图像、分割的最终图像和三个分析图。
5. 导航工具栏
注意：导航工具栏包含在所有图形窗口中，可用于在数据集中导航。工具栏底部的每个按钮如下所述。
- 若要在以前定义的视图之间来回导航，请使用 "前进 "和" 后退 "按钮。
注意：" 开始"、" 前进"和" 后退 "按钮类似于 Web 浏览器上的" 开始"、" 前进"和 "后退" 控件。 主页 返回到默认屏幕，即原始图像。 - 使用" 缩放"按钮进行平移和缩放。若要激活平移和缩放，请按下" 缩放 "按钮，然后将鼠标移动到图像中的所需位置。
- 要平移图形，请按住鼠标左键，同时将其拖动到新位置。松开鼠标按钮，图像中的选定点将显示在新位置。平移时，按住 x 或 y 键以分别将运动限制为 x 轴或 y 轴。
- 要缩放，请按住鼠标右键并将其拖动到新位置。向右移动以放大 x 轴，向左移动以在 x 轴上缩小。对 y 轴和上/下运动执行相同的操作。缩放时，请注意鼠标下方的点保持静止，允许在该点周围放大或缩小。使用修饰键 x、 y 或 CONTROL 分别将缩放限制为 x、 y 或宽高比保留。
- 要激活缩放到矩形模式，请单击缩放 到矩形 按钮。将光标放在图像上，然后按鼠标左键。按住按钮将鼠标拖动到新位置以定义矩形区域。
注： 按下鼠标左键时，轴视图限制将缩放到定义的区域。按下鼠标右键时，轴视图限制将被缩小，并将原始轴放置在定义的区域中。 - 使用 子情节配置 工具配置子情节的外观。
注： 子图的左侧、右侧、顶部和底部以及行和列之间的空间可以拉伸或压缩。 - 若要打开文件保存对话框，请单击" 保存 "按钮，然后按以下格式保存文件：.png、.ps、.eps、.svg或.pdf。
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Representative Results
对培养物中树突状网络的图像进行了代表性分析。细胞被提取如Baranes 等人所描述的那样。16，17.简而言之，从产后大鼠的大脑中提取海马细胞，并在2D玻璃盖玻片上培养1-2周。然后将培养物固定并通过间接免疫荧光染色，使用针对树突状蛋白标志物微管相关蛋白2（MAP2）的抗体进行染色。使用荧光显微镜收集树突状网络的图像，并使用SOA处理10张图像。
图 1 显示了用于分析树突网络的典型 SOA 工作流。输入是2D荧光显微镜图像。图像分割分两个阶段进行：第一阶段是将树枝状分支识别为线，第二阶段是根据用户确定的距离和方向标准合并相关线。分割后，收集每个已识别树突分支的空间信息。然后，从图像中所有树突分支的数据中提取以下信息：平行/非平行分类，平行与非平行树突分支的平均长度，平行树突分支之间的距离以及角度分布。
图2说明了图1中列出的应用于用荧光抗MAP2抗体标记的树突状网络的代表性2D图像的工作流程。开发了图形用户界面（GUI），用户可以在其中从一组文件中选择和上传图像（步骤1）。然后，用户可以修改"边缘"设置（步骤 2）和"合并线"设置（步骤 3）。之后，检测代表已识别树突分支的线（步骤2），然后根据分割线的接近度及其方向差异（步骤3）进行合并。GUI 允许将原始图像与分割图像进行比较（步骤 3），并提供对分割设置的任何更改的影响的实时监控。然后分析收集的空间信息，并将结果显示为图形或表格（图3，图4，图5和图6）
图3 显示了树突分支如何分为生长平行（图3A）和非平行（图3B）。所有归类为"非平行"的航段均不平行于任何其他航段。由于树突分支实际上并不以直线延伸，因此需要为平行生长的定义提供一定程度的自由。为了实现这一点，测量了特定分支的方向，然后允许围绕测量方向的一系列角度以实现并行性。此范围对于每个图像是固定的，并且取决于检测到的行数;但是，它不能超过10°（并行度排序过程的详细说明在 补充材料/分析，第1节中给出）。然后，检查所有其他分支的方向与此角度范围的适用性。分析完成后，提取测试范围内的并行分支数量，并将其绘制在频率图中（图3C）。
为了了解树突状支之间的平行生长程度是随机的还是定向的，将 图3C 中的图表结果与从模拟中提取的与培养物中树突枝的线数相同数量的线的模拟结果进行了比较（图3D）。然后，SOA 测量平行分支之间的距离（图 4）以及平行和非平行树突分支的长度。 图5 显示了非平行树突分支（图5A）和平行树突分支（图5B）的长度及其平均长度的条形图。为了确定是否存在优先生长方向，SOA 显示了树突分支生长角度的分布直方图（图 6）。这种演示允许快速识别首选生长方向并识别每组中的特定树突分支（通过ID号）（图6A）。
图3：树枝状分支平行生长与随机模拟的分类。 由 SOA 识别的 图 2B 中图像的树枝状分支被分类为 （A） 并行和 （B） 非并行。（C） 收集每个角度范围内平行树突分支的数量，并将其分成成对/三重/四重奏组，如 补充材料/分析，第1节所述。每个组的出现频率如图所示。（D）从随机线分布模拟中提取的平行线分组结果。缩写：SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：平行树突分支之间距离的 SOA 测量值。 图中显示了 SOA 如何显示并行增长的分支之间的距离的示例。检测到的每个树突都会收到一个唯一的编号（ID号）。SOA 测量每对平行树突之间的最小距离。详细说明可以在 补充材料/分析，第1节中找到。示例：1.树突分支ID= 2与另一个分支的距离为60μm。2. 枝晶ID=17有两个平行的分支，距离分别为60μm和13.7μm。缩写：SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：SOA 显示平行分支与非平行树突分支的长度分布。 图中显示了 SOA 对 （A） 非平行分支和 （B） 平行树枝长度以及平均长度的比较的频率图分布。缩写：SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：SOA 显示树突分支的角度分布。 （A）根据其生长角度对每条已识别的线进行图形表示。（B） 显示A ，可以快速识别首选生长方向。结合 A 和 B，每个树突分支可以分配给特定的生长方向类别。这种树突生长方向分布的表示形式允许快速识别首选的生长方向（B：柱越高，该生长方向更优选）和树突不生长的方向（B：在没有柱的角度，树突不在同一方向上生长）。缩写：SOA = 分割和方向分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充材料。请点击此处下载此文件。
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Discussion
迫切需要从2D图像中提取形态信息的有效策略，以跟上生物成像数据。虽然成像数据可以在几小时内生成，但对图像的深入分析需要很长时间。因此，图像处理显然已成为许多领域的主要障碍。这部分是由于数据的高度复杂性，特别是在处理生物样本时。此外，由于许多用户缺乏专门的编程和图像处理技能，因此需要自动化工具，以便以简单和用户友好的方式完成图像处理。这就是为什么SOA有望发挥作用的原因。代表性结果展示了自动分割，尽管树突网络很复杂，但只需几个简单的步骤即可识别图像中的树突分支。工作流程简单直观，可立即获得多样化的空间信息，无需费力。采用几种算法来检测荧光图像中的单个树突分支，并对结果进行多次分析。有关算法的详细说明，请参阅 补充材料 和系统要求信息。本文将简要介绍算法及其在软件中的作用。
分割
细分是这个项目最具挑战性的部分。在分割中，数字图像被转换为多个片段（图像对象）。分割的目的是识别图像中的对象，从而使它们更易于理解和可用。在这里，利用分割来识别树突分支并将其与背景隔离。图像分割过程分为两个阶段：第一阶段涉及将树突树枝检测为线，第二阶段涉及根据用户设置的距离和方向标准合并相关线。
树突信息与分析
收集了有关检测到的每条线的位置，角度和长度的信息。该软件对从图像中识别的所有行中获得的数据执行以下分析：1.树突分支分类（平行/非平行） 2。测量了平行与非平行树突分支的平均长度。3. 角度分布测量与显示 4.平行树枝之间的距离测量
SOA 的用户界面允许用户从计算机的文件中上传图像。它还允许调整分割设置。由于每个树突网络图像都是唯一的，因此我们建议对设置进行"修补"，以实现最佳的分割效果。用户界面允许比较原始图像和分割图像，并立即监控设置中任何更改对分割的影响。
修改所有设置后，SOA 会创建分段的最终图，其中显示了每个已识别的树突分支。SOA 生成所执行分析的图形和包含所有数据的.xlsx文件。
SOA的输出可以用作进一步分析的工具输入的起点。例如，我们现在正在开发软件，用于计算树突的平均并行度值，这些树突使用大量图像上的SOA输出接受了各种处理。
总结
SOA 是一种自动化工具，用于从复杂的 2D 线网络的图像中识别、分割和提取重要的形态信息，并具有用户友好且直观的界面。在这项工作中，通过树突网络分析的示例引入了SOA的使用。SOA可用于分析其他类型的2D细胞网络，例如不同神经和非神经细胞的网络，细胞内复合结构例如由细胞骨架和非生物网络产生的那些，例如纳米管等。SOA是为一个非常特定的目的而开发的，了解它的优点和局限性是很重要的。SOA的局限性包括它仅适用于2D图像分析，而不适用于3D图像分析。SOA 只能用于分析具有类似线条的对象的图像。此外，从软件获得的信息仅限于已识别树突的空间信息和此处描述的具体分析。SOA 不执行其他分析。该软件的主要优点是其简单性和用户友好性。该软件允许通过几个简单的步骤快速分析复杂的图像。此外，SOA是灵活的，易于调节的;因此，其分析能力可以扩展到形态测量之外，并且对其他应用有益。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢Orly Weiss博士准备的文化图像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team. | 3.4.2 | a Python 2D plotting library |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | artist for matplotlib to display a scale bar |
| NumPy | The NumPy community. | 1.20.3 | fundamental package for scientific computing library |
| OpenCV | OpenCV team | 4.5.2.54 | Open Source Computer Vision Library |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1 (Community Edition) version | Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | manage the GUI |
| python | Python Software Foundation License | 3.9 version | |
| Qt Designer | The QT Company Ltd. | 5.11.1 version | |
| scipy | Community library project | 1.6.3 | Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering |
| Seaborn | Michael Waskom. | 0.11.1 | Python's Statistical Data Visualization Library. |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | Python module for creating Excel XLSX files |
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