Summary
प्रस्तुत एक कम्प्यूटेशनल उपकरण है जो 2 डी प्रतिदीप्ति छवियों से न्यूरोनल डेंड्राइटिक शाखाओं के झुकाव के सरल और प्रत्यक्ष स्वचालित माप की अनुमति देता है।
Abstract
न्यूरोनल डेंड्राइटिक पेड़ों की संरचना न्यूरॉन्स में सिनैप्टिक इनपुट के एकीकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसलिए, न्यूरोनल फ़ंक्शन की बेहतर समझ के लिए डेंड्राइट्स की आकृति विज्ञान का लक्षण वर्णन आवश्यक है। हालांकि, डेंड्राइटिक पेड़ों की जटिलता, दोनों जब अलग-थलग और विशेष रूप से न्यूरोनल नेटवर्क के भीतर स्थित होती है, तो पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। हमने एक नया कम्प्यूटेशनल टूल, एसओए (सेगमेंटेशन और ओरिएंटेशन एनालिसिस) विकसित किया है, जो 2 डी न्यूरोनल संस्कृतियों की प्रतिदीप्ति छवियों से डेंड्राइटिक शाखाओं के अभिविन्यास के स्वचालित माप की अनुमति देता है। एसओए, पायथन में लिखा गया है, छवि पृष्ठभूमि से डेंड्राइटिक शाखाओं को अलग करने के लिए विभाजन का उपयोग करता है और प्रत्येक शाखा की स्थानिक दिशा पर एक डेटाबेस जमा करता है। डेटाबेस का उपयोग तब रूपात्मक मापदंडों की गणना करने के लिए किया जाता है जैसे कि नेटवर्क में डेंड्राइटिक शाखाओं का दिशात्मक वितरण और समानांतर डेंड्राइटिक शाखा विकास का प्रसार। प्राप्त डेटा का उपयोग न्यूरोनल गतिविधि के जवाब में डेंड्राइट्स में संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने और जैविक और औषधीय उत्तेजनाओं के लिए किया जा सकता है।
Introduction
डेंड्राइटिक मॉर्फोजेनेसिस तंत्रिका विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, क्योंकि डेंड्राइटिक पेड़ की संरचना न्यूरॉन्स 1,2,3 में सिनैप्टिक एकीकरण के कम्प्यूटेशनल गुणों को प्रभावित करती है। इसके अलावा, डेंड्राइटिक शाखाओं में रूपात्मक असामान्यताएं और संशोधन अपक्षयी और न्यूरो-विकास संबंधी विकारों 4,5,6 में फंस गए हैं। न्यूरोनल संस्कृतियों में जहां डेंड्राइटिक प्रभाव को अधिक आसानी से कल्पना की जा सकती है, गैर-बहन डेंड्राइटिक शाखाओं के बीच बातचीत शाखाओं के साथ सिनैप्टिक क्लस्टरिंग की साइटों और सीमा को विनियमित करती है, एक व्यवहार जो सिनैप्टिक कोएक्टिविटी और प्लास्टिसिटी को प्रभावित कर सकता है7,8,9। इसलिए, दो-आयामी (2 डी) न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग करके डेंड्राइटिक पेड़ के रूपात्मक मापदंडों का लक्षण वर्णन डेंड्राइटिक मॉर्फोजेनेसिस और एकल और न्यूरॉन्स के नेटवर्क की कार्यक्षमता को समझने के लिए फायदेमंद है। फिर भी, यह एक चुनौतीपूर्ण कार्य है क्योंकि डेंड्राइटिक शाखाएं "सरलीकृत" 2 डी न्यूरोनल संस्कृतियों में भी एक जटिल जाल बनाती हैं।
डेंड्राइटिक संरचनाओं का स्वचालित रूप से पता लगाने और उनका विश्लेषण करने के लिए कई उपकरण विकसित किए गए हैं10,11,12,13। हालांकि, इनमें से अधिकांश उपकरण 3 डी न्यूरोनल नेटवर्क के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और स्वाभाविक रूप से 2 डी नेटवर्क के साथ उपयोग करने के लिए बहुत जटिल हैं। इसके विपरीत, कम उन्नत रूपात्मक विश्लेषण उपकरणों में आमतौर पर कंप्यूटर-सहायता प्राप्त मैनुअल श्रम का एक महत्वपूर्ण घटक शामिल होता है, जो बहुत समय लेने वाला और ऑपरेटर पूर्वाग्रह 14 के लिए अतिसंवेदनशील होता है। मौजूदा अर्ध-स्वचालित उपकरण, जैसे 'ImageJ'15 (समुदाय-विकसित जैविक छवि विश्लेषण उपकरणों के विशाल संग्रह के साथ एक एनआईएच ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग पैकेज), काफी हद तक उपयोगकर्ता मैनुअल श्रम को कम करते हैं। हालांकि, छवि प्रसंस्करण के दौरान अभी भी कुछ मैनुअल हस्तक्षेपों की आवश्यकता होती है, और विभाजन की गुणवत्ता वांछनीय से कम हो सकती है।
यह पेपर एसओए प्रस्तुत करता है, एक सरल स्वचालित उपकरण जो 2 डी न्यूरोनल नेटवर्क के भीतर डेंड्रिटिक शाखाओं के प्रत्यक्ष विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण की अनुमति देता है। एसओए 2 डी छवियों में विभिन्न लाइन जैसी वस्तुओं का पता लगा सकता है और उनके रूपात्मक गुणों को चिह्नित कर सकता है। यहां, हमने संस्कृति में डेंड्राइटिक नेटवर्क की 2 डी प्रतिदीप्ति छवियों में डेंड्राइटिक शाखाओं को विभाजित करने के लिए एसओए का उपयोग किया। सॉफ्टवेयर डेंड्राइटिक शाखाओं की पहचान करता है और समानांतरता और स्थानिक वितरण जैसे रूपात्मक मापदंडों के माप को सफलतापूर्वक निष्पादित करता है। एसओए को अन्य सेल प्रकारों की सेलुलर प्रक्रियाओं के विश्लेषण और गैर-जैविक नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
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Protocol
नोट: इज़राइल के स्वास्थ्य मंत्रालय ने प्रायोगिक जानवरों के नैतिक उपयोग के लिए प्रोटोकॉल IL-218-01-21 के तहत चूहों के उपयोग को मंजूरी दे दी। SOA केवल विंडोज 10 और पायथन 3.9 के साथ संगत है। यह एक ओपन-सोर्स कोड के रूप में उपलब्ध है: https://github.com/inbar2748/DendriteProject। इस लिंक पर, वहाँ भी एक README है. डीएम फ़ाइल जिसमें सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करने के लिए निर्देश हैं, सॉफ़्टवेयर की वेबसाइट का एक लिंक, और सभी पैकेजों के आवश्यक संस्करणों पर जानकारी वाली एक आवश्यकता फ़ाइल। सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किए गए विश्लेषण के अतिरिक्त उदाहरण भी वहां प्रदान किए गए हैं।
चित्रा 1: विभाजन और विकास दिशा विश्लेषण के लिए SOA वर्कफ़्लो। दिखाया गया है डेंड्राइटिक नेटवर्क और डेटा विश्लेषण के फ्लोरोसेंट छवियों के प्रसंस्करण चरण हैं। 2 डी छवि अपलोड की जाती है, विभाजित होती है (दो चरणों में: डेंड्राइटिक शाखाओं को लाइनों के रूप में पता लगाया जाता है, और फिर प्रासंगिक लाइनों को विलय कर दिया जाता है), और प्रत्येक डेंड्राइटिक शाखा की स्थानिक जानकारी प्राप्त की जाती है। डेटा छवि में सभी डेंड्राइटिक शाखाओं के लिए एकत्र किए जाते हैं। अंत में, वांछित रूपात्मक मापदंडों को देने के लिए डेटा का विश्लेषण किया जाता है। संक्षिप्त नाम: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
1. SOA अनुप्रयोग खोलें।
- URL पता खोलें: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, SOA.zip ज़िप्ड फ़ोल्डर ढूँढें, और डबल-क्लिक करके ZIP फ़ाइल डाउनलोड करें.
- SOA पर राइट-क्लिक करके फ़ोल्डर खोलें.zip और फ़ाइलें निकालें चुनें। निष्कर्षण पथ और विकल्प विंडो जो खुलता है और निकाली गई फ़ाइलों के लिए पथ प्रदर्शित करता है जो गंतव्य पता पाठ बॉक्स का निरीक्षण करें। किसी भिन्न स्थान पर निकालने के लिए, इसे गंतव्य फ़ोल्डर बनाने के लिए विंडो के दाएँ पैनल में फ़ोल्डर्स में से किसी एक पर क्लिक करें. उस फ़ोल्डर में फ़ाइलें निकालने के लिए ठीक क्लिक करें.
- निकाली गई SOA फ़ाइल खोलें और SOA.exe पर डबल-क्लिक करें। एक काली खिड़की के खुलने की प्रतीक्षा करें, जिसके बाद एप्लिकेशन दिखाई देगा।
चित्र 2: SOA के GUI का उपयोग कर किसी वर्कफ़्लो का उदाहरण. बायाँ स्तंभ: वर्कफ़्लो के GUI अनुभाग. मध्य स्तंभ: एक डेंड्राइटिक नेटवर्क की छवि, वर्कफ़्लो के दौरान संसाधित (स्केल बार: 20 μm). दायाँ स्तंभ: मध्य स्तंभ की छवियों में एक लाल आयत द्वारा चिह्नित क्षेत्र का आवर्धन (स्केल बार: 4 μm). चरण 1: एक छवि का चयन और अपलोड करना। चरण 2: विभाजन का पहला चरण उन लाइनों का पता लगाना है जो पहचाने गए डेंड्राइटिक शाखाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। चरण 3: विभाजन का दूसरा चरण व्यक्तिगत डेंड्राइटिक शाखाओं में खंड अस्तर का निकटता-आधारित विलय है। सभी चरणों की सेटिंग्स को संशोधित किया जा सकता है। संक्षिप्त रूप: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण; GUI = ग्राफ़िकल यूजर इंटरफ़ेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2. विश्लेषण करने के लिए एक छवि खोलें।
- SOA व्यूअर अपलोड मेनू पट्टी में | फ़ाइल | चुनें का चयन करें कंप्यूटर फ़ाइलों में से कोई छवि चुनें | उस पर क्लिक करें (केवल .png .jpg .tif .bmp फ़ाइलें) | | खोलें फ़ाइल | के पथ का निरीक्षण करें अगला।
3. विभाजन अनुकूलन
नोट:: SOA व्यूअर गुण मेनू पट्टी में, विभाजन प्रक्रिया सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए चयनित पैरामीटर के मान परिवर्तित करें। पैरामीटर, जैसे थ्रेशोल्ड का एक विस्तृत विवरण, पूरक सामग्री में दिया गया है।
- किनारों में, थ्रेशोल्ड का चयन करके और कोई संख्या दर्ज करके प्रदर्शन के लिए थ्रेशोल्ड समायोजित करें.
नोट:: थ्रेशोल्ड के लिए संख्या जितनी कम होगी, उतनी ही अधिक पंक्तियों का पता लगाया जाता है। थ्रेशोल्ड एक संख्या है जो 0 से 255 तक होती है। डिफ़ॉल्ट मान 0 पर सेट किया गया है. - मर्ज लाइनों में:
- मर्ज करने और कोई संख्या दर्ज करने के लिए न्यूनतम दूरी का चयन करके प्रदर्शन के लिए मर्ज करने के लिए न्यूनतम दूरी समायोजित करें.
नोट:: मर्ज करने के लिए न्यूनतम दूरी 0 से 30 पिक्सेल तक होती है। डिफ़ॉल्ट मान 20 पर सेट है। - मर्ज करने और कोई संख्या दर्ज करने के लिए न्यूनतम कोण का चयन करके प्रदर्शन के लिए मर्ज करने के लिए न्यूनतम कोण समायोजित करें.
नोट:: मर्ज करने के लिए न्यूनतम कोण 0 से 30° तक श्रेणियाँ। डिफ़ॉल्ट मान 10 पर सेट है।
- मर्ज करने और कोई संख्या दर्ज करने के लिए न्यूनतम दूरी का चयन करके प्रदर्शन के लिए मर्ज करने के लिए न्यूनतम दूरी समायोजित करें.
- Create Preview Segmentation Image पर क्लिक करें।
नोट:: सेगमेंटेशन परिणामों की पूर्वावलोकन छवि अद्यतन किए गए मानों के अनुसार प्रदर्शित किया जाएगा। इसके अलावा, मर्ज करने से पहले लाइनों की संख्या और मर्ज करने के बाद लाइनों की संख्या प्रदर्शित की जाएगी। - खंडों की अधिकतम पहचान प्राप्त करने के लिए पैरामीटर परिवर्तित करें. यदि गुण बदलने की आवश्यकता है, तो बंद करें विंडो बटन पर क्लिक करें और चरण 3.1-3.4 का पालन करें।
4. आउटपुट फ़ाइलें बनाएँ।
- विभाजन छवियों और विश्लेषण रेखांकन ों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए ठीक दबाएँ. उस स्थान का चयन करने के लिए प्रकट होने वाली विंडो का निरीक्षण करें जहाँ .xlsx फ़ाइल सहेजी जाएगी.
- कोई फ़ाइल नाम | सम्मिलित करें सहेजें | चुनें डेटा के साथ .xlsx फ़ाइल को बनाए जाने और सहेजे जाने की प्रतीक्षा करें.
नोट:: .xlsx फ़ाइल के अलावा, निम्न फ़ाइलें स्वचालित रूप से प्रदर्शित किया जाएगा: एक फ़ाइल जो मूल छवि, पंक्ति पहचान छवि, विभाजन की अंतिम छवि, और तीन विश्लेषण ग्राफ़ प्रस्तुत करता है।
5. नेविगेशन उपकरण पट्टी
नोट:: एक नेविगेशन उपकरण पट्टी सभी आकृति विंडो में शामिल है और डेटा सेट के माध्यम से नेविगेट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उपकरण पट्टी के नीचे दिए गए प्रत्येक बटन का वर्णन नीचे किया गया है।
- पहले से निर्धारित दृश्यों के बीच आगे और पीछे नेविगेट करने के लिए, अग्रेषित और पीछे बटन का उपयोग करें.
नोट:: होम, फॉरवर्ड, और बैक बटन किसी वेब ब्राउज़र पर होम, फॉरवर्ड और बैक नियंत्रण के समान होते हैं. होम डिफ़ॉल्ट स्क्रीन, मूल छवि पर लौटता है। - पैन और ज़ूम करने के लिए ज़ूम बटन का उपयोग करें। पैनिंग और ज़ूमिंग को सक्रिय करने के लिए, ज़ूम बटन दबाएं , फिर माउस को छवि में एक वांछित स्थान पर ले जाएं।
- आकृति को पैन करने के लिए, बाईं माउस बटन को किसी नई स्थिति में खींचते समय दबाकर रखें। माउस बटन को छोड़ें, और छवि में चयनित बिंदु नई स्थिति में दिखाई देगा। पैनिंग करते समय, क्रमशः एक्स या वाई अक्षों तक गति को सीमित करने के लिए एक्स या वाई कुंजी को दबाए रखें।
- ज़ूम करने के लिए, दाएँ माउस बटन दबाए रखें और इसे किसी नए स्थान पर खींचें. एक्स-अक्ष पर ज़ूम इन करने के लिए दाईं ओर ले जाएँ और x-अक्ष पर ज़ूम आउट करने के लिए बाएँ ले जाएँ. वाई-अक्ष और ऊपर / नीचे गति के लिए भी ऐसा ही करें। ज़ूम करते समय, ध्यान दें कि माउस के नीचे का बिंदु स्थिर रहता है, जिससे उस बिंदु के चारों ओर ज़ूम इन या आउट हो सकता है। ज़ूम को क्रमशः x, y, या पहलू अनुपात संरक्षित करने के लिए सीमित करने के लिए संशोधक कुंजियों x, y, या CONTROL का उपयोग करें.
- ज़ूम-टू-आयत मोड को सक्रिय करने के लिए, ज़ूम-टू-आयत बटन क्लिक करें. कर्सर को छवि पर रखें और बाएं माउस बटन दबाएं। आयताकार क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए बटन को पकड़ते समय माउस को किसी नए स्थान पर खींचें.
नोट:: अक्ष दृश्य सीमाएँ निर्धारित क्षेत्र के लिए ज़ूम किया जाएगा जब बाएँ माउस बटन दबाया जाता है। अक्षों को देखने की सीमा ज़ूम आउट की जाएगी जब सही माउस बटन दबाया जाता है, तो मूल अक्षों को परिभाषित क्षेत्र में रखा जाता है। - सबप्लॉट के प्रकटन को कॉन्फ़िगर करने के लिए सबप्लॉट-कॉन्फ़िगरेशन उपकरण का उपयोग करें।
नोट:: सबप्लॉट के बाएँ, दाएँ, ऊपरी और नीचे की भुजाओं, साथ ही पंक्तियों और स्तंभों के बीच की रिक्ति को फैलाया या संकुचित किया जा सकता है. - फ़ाइल सहेजें संवाद खोलने के लिए, सहेजें बटन क्लिक करें और फ़ाइल को निम्न स्वरूपों में सहेजें: .png, .ps, .eps, .svg, या .pdf.
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Representative Results
संस्कृति में डेंड्राइटिक नेटवर्क की छवियों पर एक प्रतिनिधि विश्लेषण किया गया था। कोशिकाओं को बर्नेस एट अल द्वारा वर्णित के रूप में निकाला गया था। 16,17. संक्षेप में, हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं को प्रसवोत्तर चूहों के दिमाग से निकाला गया था और 1-2 सप्ताह के लिए 2 डी ग्लास कवरलिप्स पर खेती की गई थी। संस्कृतियों को तब तय किया गया था और डेंड्राइटिक प्रोटीन मार्कर, सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से दाग दिया गया था। डेंड्राइटिक नेटवर्क की छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था, और एसओए का उपयोग करके 10 छवियों को संसाधित किया गया था।
चित्र 1 एक डेंड्रिटिक नेटवर्क के विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट SOA वर्कफ़्लो दिखाता है। इनपुट एक 2 डी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवि है। छवि विभाजन दो चरणों में किया जाता है: पहला चरण लाइनों के रूप में डेंड्राइटिक शाखाओं की पहचान है, और दूसरा चरण उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित दूरी और दिशा मानदंडों के अनुसार प्रासंगिक लाइनों का विलय कर रहा है। विभाजन के बाद, प्रत्येक पहचाने गए डेंड्राइटिक शाखा के लिए स्थानिक जानकारी एकत्र की जाती है। फिर, छवि में सभी डेंड्राइटिक शाखाओं के डेटा से निम्नलिखित जानकारी निकाली जाती है: समानांतर / गैर-समानांतर वर्गीकरण, समानांतर बनाम गैर-समानांतर डेंड्रिटिक शाखाओं की औसत लंबाई, समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं के बीच की दूरी, और कोणीय वितरण।
चित्रा 2 एक फ्लोरोसेंट एंटी-MAP2 एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए डेंड्रिटिक नेटवर्क की प्रतिनिधि 2 डी छवि पर लागू चित्र 1 में रखे गए वर्कफ़्लो को दर्शाता है। एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) विकसित किया गया था जिसमें उपयोगकर्ता फ़ाइलों के एक सेट (चरण 1) में से एक छवि का चयन और अपलोड कर सकता है। उसके बाद, उपयोगकर्ता किनारों सेटिंग्स (चरण 2) और मर्ज लाइन्स सेटिंग्स (चरण 3) को संशोधित कर सकते हैं। उसके बाद, पहचाने गए डेंड्राइटिक शाखाओं का प्रतिनिधित्व करने वाली रेखाओं का पता लगाया जाता है (चरण 2) और फिर खंडित लाइनों की निकटता और उनके दिशात्मक अंतर (चरण 3) के आधार पर विलय कर दिया जाता है। GUI मूल छवि की तुलना खंडित छवि (चरण 3) के लिए सक्षम बनाता है और विभाजन सेटिंग्स में किसी भी परिवर्तन के प्रभाव की वास्तविक समय निगरानी प्रदान करता है। एकत्र की गई स्थानिक जानकारी का विश्लेषण किया जाता है, और परिणामों को ग्राफ़ या तालिकाओं के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6)
चित्रा 3 दर्शाता है कि कैसे डेंड्राइटिक शाखाओं को समानांतर (चित्रा 3 ए) और गैर-समानांतर (चित्रा 3 बी) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। "गैर-समानांतर" के रूप में वर्गीकृत सभी खंड किसी भी अन्य खंड के समानांतर नहीं हैं। क्योंकि डेंड्राइटिक शाखाएं वास्तव में सीधी रेखाओं में विस्तारित नहीं होती हैं, समानांतर विकास की परिभाषा के लिए कुछ हद तक स्वतंत्रता प्रदान करने की आवश्यकता थी। इसे प्राप्त करने के लिए, एक विशेष शाखा के अभिविन्यास को मापा गया था, और फिर समानांतरता के लिए मापा अभिविन्यास के चारों ओर कोणों की एक श्रृंखला की अनुमति दी गई थी। यह सीमा प्रत्येक छवि के लिए तय की गई है और पता लगाई गई लाइनों की संख्या पर निर्भर करती है; हालांकि, यह 10 डिग्री से अधिक नहीं हो सकता है (समानांतरता सॉर्टिंग प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण पूरक सामग्री / विश्लेषण, अनुभाग 1 में दिया गया है)। फिर, इस कोण सीमा के लिए अन्य सभी शाखाओं के अभिविन्यास की फिटनेस की जांच की गई थी। एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, परीक्षण की गई सीमा के भीतर समानांतर शाखाओं की संख्या निकाली गई थी और एक आवृत्ति ग्राफ (चित्रा 3 सी) में प्लॉट की गई थी।
यह समझने के लिए कि डेंड्राइटिक शाखाओं के बीच समानांतर विकास की सीमा यादृच्छिक या निर्देशित है या नहीं, चित्रा 3 सी में ग्राफ के परिणामों की तुलना संस्कृतियों में डेंड्राइटिक शाखाओं के समान संख्या की रेखाओं के यादृच्छिक विकास के सिमुलेशन से निकाले गए लोगों से की गई थी (चित्रा 3 डी)। एसओए तब समानांतर शाखाओं (चित्रा 4) के बीच की दूरी के साथ-साथ समानांतर और गैर-समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं की लंबाई को मापता है। चित्र 5 गैर-समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं (चित्रा 5A) और समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं (चित्रा 5B) और उनकी औसत लंबाई की लंबाई के बार ग्राफ़ प्रदर्शित करता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अधिमान्य विकास दिशाएं मौजूद हैं, SOA डेंड्राइटिक शाखाओं के विकास कोणों का एक वितरण हिस्टोग्राम प्रदर्शित करता है (चित्रा 6)। इस तरह की प्रस्तुति पसंदीदा विकास दिशाओं की तेजी से पहचान और प्रत्येक समूह में विशिष्ट डेंड्राइटिक शाखाओं की पहचान (आईडी संख्या द्वारा) (चित्रा 6 ए) की अनुमति देती है।
चित्रा 3: डेंड्राइटिक शाखा समानांतर विकास बनाम यादृच्छिक सिमुलेशन का वर्गीकरण। SOA द्वारा पहचाने गए चित्र 2B में छवि की डेंड्राइटिक शाखाओं को (A) समानांतर और (B) गैर-समानांतर के रूप में वर्गीकृत किया गया था। (ग) जांचकी गई प्रत्येक कोण सीमा में समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं की संख्या एकत्र की गई थी और जोड़े/ट्रिपल/चौकड़ी के समूहों में विभाजित की गई थी जैसा कि पूरक सामग्री/विश्लेषण, खंड 1 में बताया गया है। प्रत्येक समूह की आवृत्ति आवृत्ति ग्राफ में दिखाई गई है। (डी) एक यादृच्छिक लाइन वितरण सिमुलेशन से निकाले गए समानांतर लाइनों को समूहीकृत करने के परिणाम। संक्षिप्त नाम: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: समानांतर डेंड्रिटिक शाखाओं के बीच की दूरी का एसओए माप। दिखाया गया है कि कैसे SOA समानांतर में उगाई गई शाखाओं के बीच की दूरी को प्रदर्शित करता है का एक उदाहरण है। पता लगाया गया प्रत्येक डेंड्राइट एक अद्वितीय संख्या (ID संख्या) प्राप्त करता है। SOA समानांतर डेंड्राइट्स की प्रत्येक जोड़ी के बीच न्यूनतम दूरी को मापता है। एक विस्तृत विवरण पूरक सामग्री / विश्लेषण, अनुभाग 1 में पाया जा सकता है। उदाहरण: 1. डेंड्रिटिक शाखा ID = 2 एक अन्य शाखा से 60 μm की दूरी पर है। 2. डेंड्राइट आईडी = 17 में 60 μm और 13.7 μm की दूरी पर दो समानांतर शाखाएं हैं। संक्षिप्त नाम: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: समानांतर बनाम गैर-समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं की लंबाई वितरण का एसओए का प्रदर्शन। दिखाया गया है कि (ए) गैर-समानांतर और (बी) समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं की लंबाई की एसओए की तुलना की आवृत्ति प्लॉट वितरण, साथ ही साथ औसत लंबाई भी है। संक्षिप्त नाम: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: डेंड्राइटिक शाखाओं के कोणीय वितरण का एसओए का प्रदर्शन। (ए) प्रत्येक पहचान की गई रेखा का उसके विकास कोण के अनुसार एक आरेखीय निरूपण। (बी) ए का एक प्रदर्शन जो पसंदीदा विकास दिशाओं की त्वरित पहचान की अनुमति देता है। ए और बी के संयोजन से, प्रत्येक डेंड्राइटिक शाखा को एक विशिष्ट विकास दिशा श्रेणी में आवंटित किया जा सकता है। डेंड्राइटिक विकास दिशाओं के वितरण के प्रतिनिधित्व का यह रूप पसंदीदा विकास दिशाओं की तेजी से पहचान की अनुमति देता है (बी: उच्च स्तंभ, यह विकास दिशा अधिक पसंद की जाती है) और दिशाएं जिनमें डेंड्राइट्स नहीं बढ़ते हैं (बी: एक कोण पर जहां कोई कॉलम नहीं है, डेंड्राइट्स एक ही दिशा में नहीं बढ़ते हैं)। संक्षिप्त नाम: SOA = विभाजन और अभिविन्यास विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक सामग्री. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
2 डी छवियों से रूपात्मक जानकारी निकालने के लिए प्रभावी रणनीतियों को जैविक इमेजिंग डेटा के साथ रखने के लिए तत्काल आवश्यक है। हालांकि इमेजिंग डेटा घंटों में उत्पन्न किया जा सकता है, छवियों के गहन विश्लेषण में लंबा समय लगता है। नतीजतन, छवि प्रसंस्करण स्पष्ट रूप से कई क्षेत्रों में एक प्रमुख बाधा बन गया है। यह डेटा की उच्च जटिलता के कारण है, खासकर जब जैविक नमूनों से निपटते हैं। इसके अलावा, जैसा कि कई उपयोगकर्ताओं को विशेष प्रोग्रामिंग और छवि प्रसंस्करण कौशल की कमी होती है, स्वचालित उपकरण जो छवि प्रसंस्करण को आसान और उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से करने की अनुमति देते हैं, की आवश्यकता होती है। यही कारण है कि SOA उपयोगी होने की उम्मीद है। प्रतिनिधि परिणाम स्वचालित विभाजन को प्रदर्शित करते हैं जो डेंड्रिटिक नेटवर्क की जटिलता के बावजूद कुछ सरल चरणों में छवि में डेंड्राइटिक शाखाओं की पहचान करने में सक्षम बनाता है। कार्य प्रक्रिया सरल और सहज है, और विविध स्थानिक जानकारी तुरंत और प्रयास के बिना प्राप्त की जाती है। प्रतिदीप्ति छवियों में व्यक्तिगत डेंड्राइटिक शाखाओं का पता लगाने और परिणामों पर कई विश्लेषण करने के लिए कई एल्गोरिदम को नियोजित किया गया था। एल्गोरिदम का एक विस्तृत विवरण पूरक सामग्री और सिस्टम आवश्यकताओं पर जानकारी में पाया जा सकता है। यह पेपर संक्षेप में एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर में उनकी भूमिका को प्रस्तुत करेगा।
विभाजन
विभाजन इस परियोजना का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा था। विभाजन में, एक डिजिटल छवि को कई खंडों (छवि वस्तुओं) में परिवर्तित किया जाता है। विभाजन का उद्देश्य छवि में वस्तुओं की पहचान करना है और इस प्रकार उन्हें अधिक समझने योग्य और उपलब्ध बनाना है। यहां, विभाजन का उपयोग डेंड्राइटिक शाखाओं की पहचान करने और उन्हें पृष्ठभूमि से अलग करने के लिए किया गया था। छवि विभाजन प्रक्रिया को दो चरणों में विभाजित किया गया था: पहले चरण में लाइनों के रूप में डेंड्राइटिक शाखाओं का पता लगाना शामिल था, और दूसरे चरण में उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित दूरी और दिशा मानदंडों के आधार पर संबंधित लाइनों को विलय करना शामिल था।
डेंड्राइटिक जानकारी और विश्लेषण
पता लगाए गए प्रत्येक पंक्ति के स्थान, कोण और लंबाई के बारे में जानकारी एकत्र की गई थी। सॉफ्टवेयर छवि में पहचानी गई सभी लाइनों से प्राप्त डेटा पर निम्नलिखित विश्लेषण करता है: 1. डेंड्रिटिक शाखा वर्गीकरण (समानांतर / गैर-समानांतर) 2। समानांतर बनाम गैर-समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं की औसत लंबाई को मापा गया था। 3. कोणीय वितरण माप और प्रदर्शन 4. समानांतर डेंड्राइटिक शाखाओं के बीच दूरी मापन
SOA का उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस उपयोगकर्ताओं को कंप्यूटर की फ़ाइलों से एक छवि अपलोड करने की अनुमति देता है। यह विभाजन सेटिंग्स के समायोजन के लिए भी अनुमति देता है। क्योंकि प्रत्येक डेंड्राइटिक नेटवर्क छवि अद्वितीय है, हम सबसे अच्छा संभव विभाजन प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स के साथ "टिंकरिंग" का सुझाव देते हैं। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस मूल और खंडित छवियों की तुलना और विभाजन पर सेटिंग्स में किसी भी परिवर्तन के प्रभाव की तत्काल निगरानी के लिए अनुमति देता है।
सभी सेटिंग्स को संशोधित करने के बाद, SOA विभाजन का अंतिम आंकड़ा बनाता है जो प्रत्येक पहचानी गई डेंड्राइटिक शाखाओं को दिखाता है। SOA किए गए विश्लेषणों के ग्राफ़ और सभी डेटा के साथ एक .xlsx फ़ाइल उत्पन्न करता है।
एसओए के आउटपुट को आगे के विश्लेषण के लिए उपकरणों के इनपुट के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अब हम ऐसे सॉफ़्टवेयर विकसित कर रहे हैं जो डेंड्राइट्स के लिए औसत समांतरता मूल्य की गणना करता है जिन्होंने बड़ी संख्या में छवियों पर एसओए आउटपुट का उपयोग करके विभिन्न उपचार प्राप्त किए हैं।
सारांश
SOA जटिल 2 डी लाइन नेटवर्क की छवियों से महत्वपूर्ण रूपात्मक जानकारी की पहचान, विभाजन और निष्कर्षण के लिए एक स्वचालित उपकरण है और इसमें उपयोगकर्ता के अनुकूल और सहज ज्ञान युक्त इंटरफ़ेस है। इस काम में, एसओए का उपयोग डेंड्राइटिक नेटवर्क के विश्लेषण के एक उदाहरण के माध्यम से पेश किया गया था। एसओए का उपयोग अन्य प्रकार के 2 डी सेलुलर नेटवर्क के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसे कि विभिन्न तंत्रिका और गैर-तंत्रिका कोशिकाओं के नेटवर्क, इंट्रासेल्युलर जटिल संरचनाएं जैसे कि साइटोस्केलेटन और गैर-जैविक नेटवर्क द्वारा उत्पन्न, उदाहरण के लिए, नैनोट्यूब और अधिक। SOA को एक बहुत ही विशिष्ट उद्देश्य के लिए विकसित किया गया था, और इसके फायदों और सीमाओं को जानना महत्वपूर्ण है। एसओए की सीमाओं में यह तथ्य शामिल है कि यह केवल 2 डी छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और 3 डी छवि विश्लेषण के लिए नहीं। SOA का उपयोग केवल उन वस्तुओं के साथ छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है जो लाइन जैसी हैं। इसके अलावा, सॉफ़्टवेयर से प्राप्त जानकारी पहचाने गए डेंड्राइट्स की स्थानिक जानकारी और यहां वर्णित विशिष्ट विश्लेषणों तक सीमित है। अतिरिक्त विश्लेषण SOA द्वारा निष्पादित नहीं किए जाते हैं। सॉफ़्टवेयर के प्रमुख लाभ इसकी सादगी और उपयोगकर्ता-मित्रता हैं। सॉफ्टवेयर जटिल छवियों को जल्दी से और कुछ आसान चरणों में विश्लेषण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एसओए लचीला और आसानी से समायोज्य है; इसलिए, इसकी विश्लेषणात्मक क्षमता को मॉर्फोमेट्री से परे बढ़ाया जा सकता है और अन्य अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
लेखक संस्कृति छवियों की तैयारी के लिए डॉ ओरली वीस को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team. | 3.4.2 | a Python 2D plotting library |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | artist for matplotlib to display a scale bar |
| NumPy | The NumPy community. | 1.20.3 | fundamental package for scientific computing library |
| OpenCV | OpenCV team | 4.5.2.54 | Open Source Computer Vision Library |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1 (Community Edition) version | Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | manage the GUI |
| python | Python Software Foundation License | 3.9 version | |
| Qt Designer | The QT Company Ltd. | 5.11.1 version | |
| scipy | Community library project | 1.6.3 | Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering |
| Seaborn | Michael Waskom. | 0.11.1 | Python's Statistical Data Visualization Library. |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | Python module for creating Excel XLSX files |
References
- Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. Functional impact of dendritic branch-point morphology. Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 206-221 (2008).
- Chklovskii, D. Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin. Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).
- Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).
- Irwin, S. Dendritic Spine Structural Anomalies in Fragile-X Mental Retardation Syndrome. Cerebral Cortex. 10 (10), 1038-1044 (2000).
- Kaufmann, W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Pinchas, M., Baranes, D. Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering. PLoS ONE. 8 (12), 82083 (2013).
- Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs. Brain Research. 1251, 30-41 (2009).
- Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity. PLoS ONE. 3 (11), 3782 (2008).
- Glaser, J., Glaser, E. Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy. Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).
- Torben-Nielsen, B. An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies. Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).
- Parekh, R., Ascoli, G. Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience. Neuron. 78 (1), 206 (2013).
- heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis. 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).
- Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2021).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).
- Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
