Summary
提示は2D蛍光画像からの神経樹状枝の向きを簡単かつ直接自動で測定できる計算ツールです。
Abstract
神経樹状樹木の構造は、ニューロンのシナプス入力の統合において重要な役割を果たしています。したがって、樹状突起の形態の特徴付けは、神経機能のより良い理解のために不可欠である。しかし、樹状樹木の複雑さは、孤立した場合、特に神経ネットワーク内に位置する場合の両方で、完全には理解されていません。2D神経細胞培養物の蛍光画像から樹状枝の向きを自動測定できる新しい計算ツール 「SOA (セグメンテーション・オリエンテーション分析)」を開発しました。Python で書かれた SOA は、樹状の枝と画像の背景を区別するためにセグメンテーションを使用し、各ブランチの空間方向にデータベースを蓄積します。次に、ネットワーク内の樹状枝の方向分布や、並列樹状枝成長の有病率などの形態学的パラメータを計算するために使用されます。得られたデータは、神経活性に応答して樹状突起の構造変化を検出し、生物学的および薬理学的刺激に使用することができる。
Introduction
樹状形態形成は神経科学の中心的な主題であり、樹状樹木の構造はニューロンのシナプス統合の計算特性に影響を及ぼす1,2,3。また、樹状枝の形態異常や変形性は、変性・神経発達障害の4,5,6に関係しています。樹状の影響がより容易に可視化できる神経培養において、非姉妹樹状枝間の相互作用は、分岐に沿ったシナプスクラスタリングの部位および程度を調節し、シナプス共活動および可塑性に影響を及ぼす可能性のある行動7,8,9である。したがって、二次元(2D)ニューロン培養を用いた樹状樹木の形態学的パラメータの特徴づけは、樹状形態形成およびニューロンの単一およびネットワークの機能性を理解するために有利である。しかし、樹状枝は「単純化された」2Dニューロン培養においても複雑なメッシュを形成するため、これは困難な作業です。
樹状構造10,11,12,13を自動的にトレースし解析するツールがいくつか開発されています。しかし、これらのツールのほとんどは3Dニューロンネットワーク用に設計されており、2Dネットワークでは使用するには複雑すぎます。対照的に、あまり高度でない形態学的解析ツールは、通常、非常に時間がかかり、オペレータbias14の影響を受けやすいコンピュータ支援手作業の重要なコンポーネントを含みます。「ImageJ'15(コミュニティ開発の生物学的画像解析ツールの膨大なコレクションを持つNIHオープンソース画像処理パッケージ)」などの既存の半自動ツールは、ユーザーの手作業を大幅に削減します。ただし、画像処理中に手動で介入する必要がある場合があり、セグメンテーションの品質が望ましいものよりも低くなる可能性があります。
本論文では、2Dニューロンネットワーク内の樹状枝を直接セグメンテーション・オリエンテーション解析できるシンプルな自動化ツール「SOA」を紹介する。SOA は、2D 画像内のさまざまな線状オブジェクトを検出し、その形態学的特性を特徴付けることができます。ここでは、培養中の樹状ネットワークの2D蛍光画像で樹状枝をセグメント化するためのSOAを用いた。ソフトウェアは樹状枝を識別し、並列処理や空間分布などの形態学的パラメータの測定を正常に行います。SOAは、他の細胞タイプの細胞プロセスの解析や非生物学的ネットワークの研究に容易に適応することができます。
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Protocol
注:イスラエル保健省は、実験動物の倫理的使用のためのプロトコルIL-218-01-21の下でマウスの使用を承認しました。SOA は、Windows 10 および Python 3.9 とのみ互換性があります。これは、オープンソースコードとして利用可能です: https://github.com/inbar2748/DendriteProject。このリンクには README もあります。ソフトウェアをダウンロードするための指示、ソフトウェアのウェブサイトへのリンク、およびすべてのパッケージの必要なバージョンに関する情報を含む要件ファイルを持つDMファイル。ソフトウェアを使用して実行される分析の追加の例も提供されています。
図1:セグメンテーションおよび成長方向解析のSOAワークフロー 樹状ネットワークの蛍光画像の処理ステップとデータ解析を示す。2D画像はアップロードされ、セグメント化され(樹状枝は線分として検出され、関連する線がマージされる)、各樹状枝の空間情報が得られます。データは、画像内のすべての樹状枝に対して収集されます。最後に、データを分析して、所望の形態学的パラメータを与える。略語: SOA = セグメンテーションと方向解析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. SOA アプリケーションを開きます。
- URL アドレスを開きます: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA、 SOA .zip zip 形式のフォルダーを見つけて、ZIP ファイルをダブルクリックしてダウンロードします。
- SOA を右クリックしてフォルダを解凍し.zipファイルの展開を選択します。開いた [抽出パスとオプション] ウィンドウと、抽出されたファイルのパスを表示する [宛先アドレス] テキスト ボックスを確認します。別の場所に展開するには、ウィンドウの右側のパネルでいずれかのフォルダをクリックして、コピー先のフォルダにします。[OK] をクリックして、そのフォルダにファイルを展開します。
- 抽出した SOA ファイルを開き、 SOA .exe をダブルクリックします。黒いウィンドウが開くのを待ち、その後にアプリケーションが表示されます。
図2:SOAのGUIを使用したワークフローの例 左列: ワークフローの GUI セクション。中央の列: 樹状ネットワークの画像, ワークフロー中に処理(スケールバー: 20 μm)。右の列: 中央の列の画像に赤い長方形でマークされた領域の拡大率(スケールバー:4 μm)。ステップ 1: 画像の選択とアップロード。ステップ2:セグメンテーションの第1段階は、識別された樹状枝を表す線の検出です。ステップ3:セグメンテーションの第2段階は、個々の樹状枝のセグメント裏地の近接ベースの合併です。すべてのステップの設定は変更できます。略語: SOA = セグメンテーションと方向分析;GUI = グラフィカル・ユーザー・インターフェース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 画像を開いて分析します。
- SOA ビューアアップロードメニューバー|[ファイルの選択] |コンピュータファイルから画像を選択|クリック (ファイルのみ.png .jpg .tif .bmp) ||を開く ファイルのパスを|次に。
3. セグメンテーションの最適化
注: [SOA ビューアのプロパティ] メニュー バーで、選択したパラメータの値を変更してセグメンテーションプロセスの設定を調整します。 しきい値などのパラメータの詳細な説明は、 補足材料に記載されています。
- [エッジ] で、[しきい値] を選択して数値を入力して、表示のしきい値を調整します。
注: しきい値の数が小さいほど、検出される行数が多くなります。しきい値は、0 から 255 の範囲の数値です。既定値は 0 に設定されています。 - マージ行で:
- 合成する最小距離を選択して数値を入力し、ディスプレイの 最小距離 を調整します。
注: マージする最小距離 は、0 ~ 30 ピクセルの範囲です。デフォルト値は 20 に設定されています。 - 合成する最小角度を選択して数値を入力して、ディスプレイにマージ する最小角度 を調整します。
注: マージする最小角度 の範囲は 0 ~ 30° です。デフォルト値は 10 に設定されています。
- 合成する最小距離を選択して数値を入力し、ディスプレイの 最小距離 を調整します。
- [ プレビュー セグメンテーション イメージの作成] をクリックします。
注: セグメンテーション結果のプレビュー イメージは、更新された値に従って表示されます。また、マージ前の行数とマージ後の行数も表示されます。 - パラメータを変更して、セグメントの識別を最大限に引き出します。プロパティを変更する必要がある場合は、 ウィンドウを閉じる ボタンをクリックして、手順3.1-3.4に従います。
4. 出力ファイルを作成します。
- [OK] を押して、セグメンテーション 画像と分析グラフを視覚化します。.xlsx ファイルを保存する場所を選択するためのウィンドウが表示されることを確認します。
- ファイル名を挿入|[ 保存] |の 選択データを含む.xlsxファイルが作成され、保存されるまで待ちます。
注: .xlsx ファイルに加えて、元の画像を表示するファイル、線の認識イメージ、セグメンテーションの最終イメージ、3 つの解析グラフが自動的に表示されます。
5. ナビゲーションツールバー
注: ナビゲーション ツールバーはすべての図ウィンドウに含まれており、データ セット内を移動するために使用できます。ツールバーの下部にある各ボタンについて、以下に説明します。
- 以前に定義したビュー間を移動するには、[ 進む ] ボタンと [戻る ] ボタンを使用します。
注: ホーム、 進む、および 戻る ボタンは、Web ブラウザーの ホーム、 進む、および 戻る の各コントロールに似ています。 ホーム はデフォルトの画面、元の画像に戻ります。 - [ズーム] ボタンを使用して、画面移動とズームを行います。パンとズームをアクティブにするには、[ズーム]ボタンを押してから、画像内の目的の場所にマウスを移動します。
- 図をパンするには、マウスの左ボタンを押したまま、新しい位置にドラッグします。マウス ボタンを放すと、イメージ内の選択したポイントが新しい位置に表示されます。パン中に 、x キーまたは y キーを押したままにして、モーションを x 軸または y 軸に制限します。
- ズームするには、マウスの右ボタンを押したまま、新しい場所にドラッグします。右に移動して X 軸を拡大表示し、左に移動して X 軸を縮小します。Y 軸と上下の動きに対して同じ操作を行います。ズームする場合、マウスの下の点は静止したままで、そのポイントの周囲を拡大または縮小できます。修飾子キー x、 y、または CONTROL を使用して、それぞれ x、 y、またはアスペクト比の保持にズームを制限します。
- 四角形にズーム モードをアクティブにするには、[ 四角形にズーム ] ボタンをクリックします。イメージの上にカーソルを置き、マウスの左ボタンを押します。ボタンを押したまま新しい位置にマウスをドラッグして、矩形領域を定義します。
注: 軸ビューの制限は、マウスの左ボタンを押すと、定義された領域にズームされます。軸ビューの制限は、マウスの右ボタンを押すと縮小され、定義された領域に元の軸が配置されます。 - サブプロット設定ツールを使用して、サブプロットの外観を設定します。
注: サブプロットの左、右、上、下の辺、行と列の間のスペースは、ストレッチまたは圧縮できます。 - ファイル保存ダイアログを開くには、[ 保存 ] ボタンをクリックし、.png、.ps、.eps、.svg、または.pdf形式でファイルを保存します。
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Representative Results
培養中の樹状ネットワークの画像に対して代表的な分析を行った。Baranesらで説明したように細胞を抽出した。16,17.簡単に言えば、海馬細胞を出生後ラットの脳から抽出し、2Dガラスのカバーリップで1〜2週間培養した。培養物を次に固定し、樹状タンパク質マーカー、微小管関連タンパク質2(MAP2)に対する抗体を用いて間接的な免疫蛍光を介して染色した。樹状ネットワークの画像を蛍光顕微鏡を用いて収集し、10枚の画像をSOAを用いて処理した。
図 1 は、樹状ネットワークの解析に使用する一般的な SOA ワークフローを示しています。入力は2D蛍光顕微鏡画像です。画像のセグメンテーションは2つの段階で行われます:第1段階は樹状枝を線として識別し、第2段階はユーザーが決定した距離と方向の基準に従って関連する線をマージする。セグメンテーション後、識別された樹状枝ごとに空間情報が収集されます。次に、画像内のすべての樹状枝のデータから、平行/非並列分類、平行/非平行樹状枝の平均長さ、平行樹状枝間の距離、角度分布から抽出されます。
図2は、蛍光抗MAP2抗体で標識された樹状ネットワークの代表的な2D画像に適用された図1に示したワークフローを示す。グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)が開発され、ユーザーはファイルのセットから画像を選択してアップロードすることができます(ステップ1)。その後、ユーザーはエッジ設定(ステップ 2)とラインのマージ設定(ステップ 3)を変更できます。その後、セグメント化された線の近接性と方向の違いに基づいて、識別された樹状枝を表す線が検出され (ステップ 2) され、マージされます (ステップ 3)。GUI は、セグメント化されたイメージと元のイメージの比較を可能にし (ステップ 3)、セグメンテーション設定の変更の影響をリアルタイムでモニタリングします。次に収集された空間情報が分析され、結果がグラフまたは表として表示されます (図 3、図 4、図 5、および図 6)。
図 3 は、樹状枝がどのように伸びる平行(図 3A)と非並列(図 3B)に分類される様子を示しています。「非平行」として分類されるすべてのセグメントは、他のセグメントと平行ではありません。樹状枝は実際には直線で伸びていないので、平行成長の定義にはある程度の自由度を提供する必要があった。これを達成するために、特定の分岐の方向を測定し、次に、測定された方向の周りの角度の範囲を並列処理に許可した。この範囲は、各イメージに固定されており、検出された行数によって異なります。ただし、10°を超えることはできません(並列ソートプロセスの詳細は 補足材料/分析セクション1で説明されています)。次に、この角度範囲に対する他のすべての枝の向きの適合性を調べた。分析が完了すると、試験範囲内の並列分岐の数を抽出し、周波数グラフにプロットしました(図3C)。
樹状枝間の平行成長の程度がランダムであるか方向であるかを理解するために、 図3C のグラフの結果を、培養中の樹状枝と同じ数のラインのランダム成長のシミュレーションから抽出したものと比較した(図3D)。SOA は、平行分岐間の距離 (図 4) と平行分岐と非平行樹状枝の長さを測定します。 図 5 は、非並列樹状枝(図 5A)と並列樹枝の長さ、およびそれらの平均長さを示す棒グラフを示しています。優先的な成長方向が存在するかどうかを判断するために、SOAは樹状枝の成長角の分布ヒストグラムを表示します(図6)。このようなプレゼンテーションでは、各グループ内の特定の樹状枝の好ましい成長方向の迅速な同定と(ID番号別)を可能にする(図6A)。
図3:樹状枝の並列成長とランダムシミュレーションの分類 図2Bで示した図 2B の樹状枝は、(A)並列及び(B)非平行と分類した。(C) 各角度範囲で平行樹状枝の数を収集し、 補足的な材料/分析、セクション1で説明したようにペア/トリプル/カルテットのグループに分割しました。各グループの出現頻度をグラフに示します。(D) ランダムライン分布シミュレーションから抽出された並列線のグループ化の結果。略語: SOA = セグメンテーションと方向解析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:平行樹状枝間の距離のSOA測定。 SOA が並行して成長した分岐間の距離を表示する例を示します。検出された各樹状突起は、一意の番号(ID番号)を受け取ります。SOA は、並列デンドライトの各ペア間の最小距離を測定します。詳細な説明は 、補足材料/分析セクション 1 を参照してください。例: 1. 樹状枝 ID=2 は、別の分岐から 60 μm の距離にあります。2. デンドライトID=17は60 μmと13.7 μmの距離に2つの平行枝を持っています。略語: SOA = セグメンテーションと方向解析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:SOAの並列枝と非平行樹状枝の長さ分布の表示 図は、SOAの(A)非平行枝と(B)平行樹状枝の長さと平均長さの比較の周波数プロット分布です。略語: SOA = セグメンテーションと方向解析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:樹状枝の角分布のSOAの表示 (A) 成長角度に従って、識別された各ラインをグラフィカルに表現したものです。(B)好ましい成長方向の迅速な認識を可能にする A の表示。 A と Bを組み合わせることで、樹状枝を特定の成長方向カテゴリに割り当てることができます。樹状成長方向の分布のこの形態の表現は、好ましい成長方向(B:カラムが高いほど、この成長方向がより好ましい)および樹状突起が成長しない方向(B:カラムがない角度で、樹状突起は同じ方向に成長しない)を迅速に同定することを可能にする。略語: SOA = セグメンテーションと方向解析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生物学的画像データに追いつくためには、2D画像から形態学的情報を抽出するための効果的な戦略が緊急に必要とされています。画像データは数時間で生成できますが、画像の詳細な分析には長い時間がかかります。その結果、画像処理は明らかに多くの分野で大きな障害となっています。これは、特に生物学的サンプルを扱う場合、データの複雑度が高いためです。また、多くのユーザーが専門的なプログラミングや画像処理のスキルを欠いているため、画像処理を容易かつユーザーフレンドリーに行える自動化ツールが必要です。SOAが役に立つと期待されているのはそのためです。代表的な結果は、樹状ネットワークの複雑さにもかかわらず、いくつかの簡単な手順で画像内の樹状枝の識別を可能にする自動セグメンテーションを示しています。作業プロセスはシンプルで直感的で、多様な空間情報をすぐに、努力することなく取得します。蛍光画像内の個々の樹状枝を検出し、その結果について複数の分析を行うために、いくつかのアルゴリズムが採用されました。アルゴリズムの詳細な説明は、 補足資料 とシステム要件に関する情報を参照してください。本稿では、ソフトウェアにおけるアルゴリズムとその役割を簡単に紹介する。
セグメンテーション
セグメンテーションは、このプロジェクトの中で最も困難な部分でした。セグメンテーションでは、デジタル画像は複数のセグメント(画像オブジェクト)に変換されます。セグメンテーションの目的は、画像内のオブジェクトを識別し、それらをより理解しやすく、利用できるようにすることです。ここでは、樹状枝を識別し、バックグラウンドからそれらを分離するためにセグメンテーションを利用した。画像の分割プロセスは2つの段階に分かれました:第1段階は樹状枝を線として検出し、第2段階ではユーザーが設定した距離と方向の基準に基づいて関連する線をマージしました。
樹状情報と分析
検出された各線の位置、角度、長さに関する情報を収集しました。ソフトウェアは、画像で識別されたすべてのラインから得られたデータに対して次の分析を実行します: 1. 樹状枝分類 (並列/非平行) 2.平行枝と非平行樹状枝の平均長さを測定した。3. 角度分布測定および表示4.平行樹状枝間の距離測定
SOAのユーザーインターフェイスは、ユーザーがコンピュータのファイルから画像をアップロードすることができます。また、セグメンテーション設定の調整も可能です。樹状ネットワークイメージはそれぞれ異なるため、最良のセグメンテーションを実現するために設定を「いじり」を提案します。ユーザーインターフェイスは、元の画像とセグメント化された画像の比較と、セグメンテーションにおける設定の変更の影響を即座に監視することができます。
すべての設定を変更した後、SOA は、識別された樹状分岐のそれぞれを示すセグメンテーションの最終図形を作成します。SOA は、実行された分析のグラフと、すべてのデータを含む.xlsxファイルを生成します。
SOAの出力は、さらなる分析のためのツールの入力の出発点として利用することができます。例えば、大量の画像に対してSOA出力を用いて、さまざまな処理を行ったデンドライトの平均並列化値を計算するソフトウェアを開発中です。
概要
SOAは、複雑な2Dラインネットワークの画像から重要な形態情報を識別、セグメンテーション、抽出するための自動化ツールであり、ユーザーフレンドリーで直感的なインターフェースを備えています。本研究では、樹状ネットワークの解析例を通じてSOAの利用が導入されました。SOAは、異なる神経細胞および非神経細胞のネットワーク、細胞骨格および非生物学的ネットワークによって生成されるような細胞内複雑な構造、例えばナノチューブおよびより多くの他のタイプの2D細胞ネットワークの分析に使用することができる。SOAは非常に特殊な目的のために開発されており、その利点と限界を知ることが重要です。SOA の制限には、2D 画像解析にのみ適しており、3D 画像解析には適していないという事実が含まれます。SOA は、線のようなオブジェクトを使用してイメージを分析する場合にのみ使用できます。さらに、ソフトウェアから得られる情報は、特定された樹状突起の空間情報およびここで説明する特定の分析に限定される。追加の分析は SOA によって実行されません。ソフトウェアの主な利点は、そのシンプルさと使いやすさです。ソフトウェアは、複雑な画像を迅速かついくつかの簡単な手順で分析することができます。さらに、SOAは柔軟で容易に調整可能です。したがって、その分析能力は、モルホメトリーを超えて拡大することができ、他のアプリケーションに有益である。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、文化イメージの準備のためにオルリー・ワイス博士に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team. | 3.4.2 | a Python 2D plotting library |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | artist for matplotlib to display a scale bar |
| NumPy | The NumPy community. | 1.20.3 | fundamental package for scientific computing library |
| OpenCV | OpenCV team | 4.5.2.54 | Open Source Computer Vision Library |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1 (Community Edition) version | Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | manage the GUI |
| python | Python Software Foundation License | 3.9 version | |
| Qt Designer | The QT Company Ltd. | 5.11.1 version | |
| scipy | Community library project | 1.6.3 | Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering |
| Seaborn | Michael Waskom. | 0.11.1 | Python's Statistical Data Visualization Library. |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | Python module for creating Excel XLSX files |
References
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