Summary
Apresentado é uma ferramenta computacional que permite a medição automática simples e direta das orientações de ramos dendríticas neuronais a partir de imagens de fluorescência 2D.
Abstract
A estrutura das árvores dendríticas neuronais desempenha um papel fundamental na integração de insumos sinápticos nos neurônios. Portanto, a caracterização da morfologia dos dendritos é essencial para uma melhor compreensão da função neuronal. No entanto, a complexidade das árvores dendríticas, tanto quando isoladas quanto especialmente quando localizadas dentro das redes neuronais, não foi completamente compreendida. Desenvolvemos uma nova ferramenta computacional, SOA (Segmentação e Análise de Orientação), que permite a medição automática da orientação de ramos dendríticos a partir de imagens de fluorescência de culturas neuronais 2D. SOA, escrito em Python, usa segmentação para distinguir ramos dendríticos do fundo da imagem e acumula um banco de dados na direção espacial de cada ramo. O banco de dados é então utilizado para calcular parâmetros morfológicos, como a distribuição direcional de ramos dendráticos em uma rede e a prevalência de crescimento dendrático paralelo do ramo. Os dados obtidos podem ser usados para detectar alterações estruturais nos dendritos em resposta à atividade neuronal e a estímulos biológicos e farmacológicos.
Introduction
A morfogênese dendrítica é um assunto central na neurociência, pois a estrutura da árvore dendrítica afeta as propriedades computacionais da integração sináptica nos neurônios1,2,3. Além disso, anormalidades morfológicas e modificações em ramos dendráticos estão implicadas em distúrbios degenerativos e neurodesenvolvimento4,5,6. Nas culturas neuronais onde a ramificação dendrítica pode ser mais facilmente visualizada, as interações entre ramos dendráticos não-irmãos regulam os locais e a extensão do agrupamento sináptico ao longo dos ramos, comportamento que pode afetar a coatividade sináptica e a plasticidade7,8,9. Portanto, a caracterização dos parâmetros morfológicos da árvore dendrítica utilizando culturas neuronais bidimensionais (2D) é vantajosa para a compreensão da morfogênese dendrítica e funcionalidade de redes únicas e de neurônios. No entanto, esta é uma tarefa desafiadora porque os ramos dendráticos formam uma malha complexa mesmo em culturas neuronais 2D "simplificadas".
Várias ferramentas foram desenvolvidas para rastrear e analisar automaticamente estruturas dendríticas10,11,12,13. No entanto, a maioria dessas ferramentas são projetadas para redes neuronais 3D e são naturalmente muito complexas para usar com redes 2D. Em contraste, ferramentas de análise morfológica menos avançadas normalmente envolvem um componente significativo do trabalho manual assistido por computador, que é muito demorado e suscetível ao viés do operador14. Ferramentas semiautomáticas existentes, como o 'ImageJ'15 (um pacote de processamento de imagem de código aberto do NIH com uma vasta coleção de ferramentas de análise biológica desenvolvidas pela comunidade), reduzem em grande parte o trabalho manual do usuário. No entanto, algumas intervenções manuais ainda são necessárias durante o processamento da imagem, e a qualidade da segmentação pode ser menor do que desejável.
Este artigo apresenta o SOA, uma ferramenta automatizada simples que permite a segmentação direta e a análise de orientação de ramos dendríticos dentro de redes neuronais 2D. O SOA pode detectar vários objetos semelhantes a linhas em imagens 2D e caracterizar suas propriedades morfológicas. Aqui, utilizamos o SOA para segmentar ramos dendríticos em imagens de fluorescência 2D de redes dendríticas na cultura. O software identifica os ramos dendráticos e realiza com sucesso medições de parâmetros morfológicos, como paralelismo e distribuição espacial. O SOA pode ser facilmente adaptado para a análise de processos celulares de outros tipos celulares e para o estudo de redes não biológicas.
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Protocol
NOTA: O Ministério da Saúde israelense aprovou o uso de camundongos sob o protocolo IL-218-01-21 para o uso ético de animais experimentais. O SOA só é compatível com o Windows 10 e o Python 3.9. Está disponível como um código de código aberto: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. Neste link, há também uma README. Arquivo DM que tem instruções para baixar o software, um link para o site do software e um arquivo de requisitos contendo informações sobre as versões necessárias de todos os pacotes. Outros exemplos de análises realizadas utilizando o software também foram fornecidos lá.
Figura 1: Fluxo de trabalho SOA para segmentação e análise de direção de crescimento. São mostradas as etapas de processamento de imagens fluorescentes de redes dendríticas e análise de dados. A imagem 2D é carregada, segmentada (em duas etapas: ramos dendráticos são detectados como linhas e, em seguida, as linhas relevantes são mescladas), e as informações espaciais de cada ramo dendrático são obtidas. Os dados são coletados para todos os ramos dendráticos da imagem. Por fim, os dados são analisados para dar os parâmetros morfológicos desejados. Abreviação: SOA = segmentação e análise de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Abra o aplicativo SOA.
- Abra o endereço de URL: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, encontre a pasta com zíper .ZIP SOA e baixe o arquivo ZIP clicando duas vezes.
- Descompacte a pasta clicando com o botão direito do mouse no SOA.zip e escolha Extrair arquivos. Observe a janela Caminho de Extração e Opções que abre e a caixa de texto Endereço de Destino que exibe o caminho para os arquivos extraídos. Para extrair para um local diferente, clique em uma das pastas no painel direito da janela para torná-la a pasta de destino. Clique em OK para extrair os arquivos para essa pasta.
- Abra o arquivo SOA extraído e clique duas vezes no SOA.exe. Aguarde a abertura de uma janela preta, após a qual o aplicativo será exibido.
Figura 2: Exemplo de fluxo de trabalho usando a GUI do SOA. Coluna esquerda: seções gui do fluxo de trabalho. Coluna média: imagem de uma rede dendrítica, processada durante o fluxo de trabalho (Barra de escala: 20 μm). Coluna direita: ampliação da área marcada por um retângulo vermelho nas imagens da coluna do meio (Barra de escala: 4 μm). Passo 1: Seleção e upload de uma imagem. Passo 2: A primeira etapa da segmentação é a detecção de linhas que representam os ramos dendráticos identificados. Passo 3: A segunda etapa da segmentação é a fusão baseada em proximidade de forro de segmento em filiais dendríticas individuais. As configurações de todas as etapas podem ser modificadas. Abreviaturas: SOA = segmentação e análise de orientação; GUI = interface gráfica do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Abra uma imagem para analisar.
- Na barra de menus SOA Viewer Upload | selecionar Escolher arquivo | escolha uma imagem dos arquivos do computador | clique nele (somente .png .jpg .tif .bmp arquivos) | | observar o caminho do arquivo | Próximo.
3. Otimização de segmentação
NOTA: Na barra de menuS SOA Viewer Properties , altere os valores dos parâmetros selecionados para ajustar as configurações do processo de segmentação. Uma descrição detalhada dos parâmetros, como o Limiar, é dada no Material Suplementar.
- Em Bordas, ajuste o limiar para o display selecionando o Limiar e digitando um número.
NOTA: Quanto menor o número do limiar, mais linhas são detectadas. Limiar é um número que varia de 0 a 255. O valor padrão foi definido para 0. - Em Linhas de Mesclagem:
- Ajuste a distância mínima para mesclar para o display selecionando a distância Min para mesclar e digitar um número.
NOTA: A distância min para mesclar varia de 0 a 30 pixels. O valor padrão está definido para 20. - Ajuste o ângulo mínimo para mesclar para o display selecionando o ângulo Min para mesclar e digitar um número.
NOTA: O ângulo Min para mesclar varia de 0 a 30°. O valor padrão está definido para 10.
- Ajuste a distância mínima para mesclar para o display selecionando a distância Min para mesclar e digitar um número.
- Clique em Criar imagem de segmentação de visualização.
NOTA: Uma imagem de visualização dos resultados de segmentação será exibida de acordo com os valores atualizados. Além disso, o número de linhas antes da fusão e o número de linhas após a fusão serão exibidos. - Alterar os parâmetros para alcançar a máxima identificação dos segmentos. Se houver necessidade de alterar as Propriedades, clique no botão Fechar a janela e siga os passos 3.1-3.4.
4. Crie os arquivos de saída.
- Pressione OK para visualizar as imagens de segmentação e os gráficos de análise. Observe a janela que aparece para selecionar um local onde o arquivo .xlsx será salvo.
- inserir um nome de arquivo | Escolha salvar | esperar que o arquivo .xlsx com dados sejam criados e salvos.
NOTA: Além do arquivo .xlsx, os seguintes arquivos serão exibidos automaticamente: um arquivo que apresenta a imagem original, a imagem de reconhecimento de linha, a imagem final da segmentação e três gráficos de análise.
5. Barra de ferramentas de navegação
NOTA: Uma barra de ferramentas de navegação está incluída em todas as janelas de figuras e pode ser usada para navegar através do conjunto de dados. Cada um dos botões na parte inferior da barra de ferramentas está descrito abaixo.
- Para navegar para frente e para trás entre as visualizações previamente definidas, use os botões Para frente e para trás .
NOTA: Os botões Home, Forward e Back são semelhantes aos controles Home, Forward e Back em um navegador da Web. Home retorna à tela padrão, à imagem original. - Use o botão Zoom para panela e zoom. Para ativar o garimpo e o zoom, pressione o botão Zoom e mova o mouse para um local desejado na imagem.
- Para a panela da figura, pressione e segure o botão esquerdo do mouse enquanto arrasta-o para uma nova posição. Solte o botão do mouse e o ponto selecionado na imagem aparecerá na nova posição. Enquanto garimpo, segure as teclas x ou y para restringir o movimento aos eixos x ou y , respectivamente.
- Para ampliar, segure o botão direito do mouse e arraste-o para um novo local. Mova-se para a direita para ampliar o eixo x e mova-se para a esquerda para diminuir o zoom no eixo x. Faça o mesmo para os movimentos y-axis e para cima/para baixo. Ao dar zoom, observe que o ponto sob o mouse permanece parado, permitindo ampliar ou sair em torno desse ponto. Use as teclas modificador x, y ou CONTROL para limitar o zoom à reserva de x, y ou proporção, respectivamente.
- Para ativar o modo Zoom-to-retângulo, clique no botão Zoom-to-retângulo . Coloque o cursor sobre a imagem e pressione o botão esquerdo do mouse. Arraste o mouse para um novo local enquanto segura o botão para definir uma região retangular.
NOTA: Os limites de visualização dos eixos serão ampliados para a região definida quando o botão esquerdo do mouse for pressionado. Os limites de visualização dos eixos serão ampliados quando o botão direito do mouse for pressionado, colocando os eixos originais na região definida. - Use a ferramenta de configuração de subtrama para configurar a aparência da subtrama.
NOTA: Os lados esquerdo, direito, superior e inferior da subtrama, bem como o espaço entre linhas e colunas, podem ser esticados ou comprimidos. - Para abrir uma caixa de diálogo de salvamento de arquivos, clique no botão Salvar e salve o arquivo nos seguintes formatos: .png, .ps, .eps, .svg ou .pdf.
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Representative Results
Uma análise representativa foi realizada em imagens de redes dendríticas na cultura. As células foram extraídas como descrito por Baranes et al. 16,17. Resumidamente, as células hipocampais foram extraídas do cérebro de ratos pós-natais e cultivadas em tampas de vidro 2D por 1-2 semanas. As culturas foram então fixadas e manchadas através da imunofluorescência indireta usando um anticorpo contra o marcador de proteína dendrítica, proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2). Imagens de redes dendríticas foram coletadas por meio de um microscópio de fluorescência, e 10 imagens foram processadas usando SOA.
A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho SOA típico para a análise de uma rede dendrítica. A entrada é uma imagem de microscópio fluorescente 2D. A segmentação de imagens é realizada em duas etapas: a primeira etapa é a identificação de ramos dendráticos como linhas, e a segunda etapa é a fusão de linhas relevantes de acordo com critérios de distância e direção determinados pelo usuário. Após a segmentação, são coletadas informações espaciais para cada ramo dendrático identificado. Em seguida, as seguintes informações são extraídas dos dados de todos os ramos dendráticos na imagem: Classificação Paralela/Não Paralela, comprimento médio de ramos dendráticos paralelos versus não paralelos, distância entre ramos dendráticos paralelos e distribuição angular.
A Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho estabelecido na Figura 1 aplicado a uma imagem 2D representativa de uma rede dendrítica rotulada com um anticorpo anti-MAP2 fluorescente. Uma Interface Gráfica de Usuário (GUI) foi desenvolvida na qual o usuário pode selecionar e carregar uma imagem de um conjunto de arquivos (Passo 1). Em seguida, o usuário pode modificar as configurações Bordas (Passo 2) e Linhas de Mesclagem (Passo 3). Na sequência, são detectadas linhas representativas dos ramos dendráticos identificados (Passo 2) e, em seguida, fundidas, com base na proximidade das linhas segmentadas e suas diferenças direcionais (Passo 3). O GUI permite a comparação da imagem original com a imagem segmentada (Passo 3) e fornece monitoramento em tempo real do efeito de quaisquer alterações nas configurações de segmentação. As informações espaciais coletadas são então analisadas e os resultados são apresentados como gráficos ou tabelas (Figura 3, Figura 4, Figura 5 e Figura 6)
A Figura 3 demonstra como os ramos dendráticos são classificados como paralelos crescentes (Figura 3A) e não paralelos (Figura 3B). Todos os segmentos classificados como "não paralelos" não são paralelos a nenhum outro segmento. Como os ramos dendráticos não se estendem em linhas retas, houve a necessidade de fornecer algum grau de liberdade para a definição de crescimento paralelo. Para isso, a orientação de um determinado ramo foi medida e, em seguida, foi permitida uma série de ângulos em torno da orientação medida para o paralelismo. Este intervalo é fixo para cada imagem e depende do número de linhas detectadas; no entanto, não pode exceder 10° (uma descrição detalhada do processo de classificação do paralelismo é dada em Material/Análise Suplementar, seção 1). Em seguida, foi examinada a aptidão da orientação de todos os outros ramos para esta faixa de ângulo. Uma vez concluída a análise, o número de ramos paralelos dentro da faixa testada foi extraído e plotado em um gráfico de frequência (Figura 3C).
Para entender se a extensão do crescimento paralelo entre os ramos dendríticas é aleatória ou direcionada, os resultados do gráfico na Figura 3C foram comparados aos extraídos da simulação de crescimento aleatório de linhas do mesmo número que os dos ramos dendráticos nas culturas (Figura 3D). SOA então mede as distâncias entre os ramos paralelos (Figura 4), bem como os comprimentos de ramos dendráticos paralelos e não paralelos. A Figura 5 exibe gráficos de barras dos comprimentos dos ramos dendráticos não paralelos (Figura 5A) e ramos dendráticos paralelos (Figura 5B) e seus comprimentos médios. Para determinar se existem direções preferenciais de crescimento, soa exibe um histograma de distribuição dos ângulos de crescimento dos ramos dendráticos (Figura 6). Tal apresentação permite a identificação rápida das direções de crescimento preferenciais e identificação de ramos dendríticas específicos em cada grupo (por número de identificação) (Figura 6A).
Figura 3: Classificação do crescimento paralelo do ramo dendrático versus simulação aleatória. Os ramos dendráticos da imagem na Figura 2B identificados pela SOA foram classificados como (A) paralelos e (B) não paralelos. (C) O número de ramos dendríticas paralelas em cada faixa de ângulo verificada foi coletado e dividido em grupos de pares/triplos/quartetos, conforme explicado em Material Suplementar/Análise, seção 1. A frequência de ocorrência de cada grupo é mostrada no gráfico. (D) Os resultados do agrupamento de linhas paralelas extraídas de uma simulação aleatória de distribuição de linhas. Abreviação: SOA = segmentação e análise de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medição soa da distância entre ramos dendráticos paralelos. Mostrado é um exemplo de como o SOA exibe a distância entre ramos cultivados em paralelo. Cada dendrite detectado recebe um número único (número de identificação). O SOA mede a distância mínima entre cada par de dendritos paralelos. Uma descrição detalhada pode ser encontrada em Material/Análise Suplementar, seção 1. Exemplos: 1. O ramal dendrático ID=2 está a uma distância de 60 μm de outro ramo. 2. Dendrite ID=17 possui dois ramos paralelos a distâncias de 60 μm e 13,7 μm. Abreviação: SOA = segmentação e análise de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exibição soa da distribuição de comprimento de ramos dendráticos paralelos versus não paralelos. Mostrado é uma distribuição de gráficos de frequência da comparação do SOA dos comprimentos de (A) ramos dendráticos paralelos e (B), bem como os comprimentos médios. Abreviação: SOA = segmentação e análise de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exibição do SOA da distribuição angular de ramos dendráticos. (A) Uma representação gráfica de cada linha identificada de acordo com seu ângulo de crescimento. (B) Uma exibição de A que permite o reconhecimento rápido das direções de crescimento preferidas. Combinando A e B, cada ramo dendrático pode ser alocado para uma categoria específica de direção de crescimento. Essa forma de representação da distribuição das direções de crescimento dendrítica permite a identificação rápida das direções preferenciais de crescimento (B: quanto maior a coluna, essa direção de crescimento é mais preferida) e direções em que os dendritos não crescem (B: em um ângulo onde não há coluna, os dendritos não crescem na mesma direção). Abreviação: SOA = segmentação e análise de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Material Suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Estratégias eficazes para extrair informações morfológicas de imagens 2D são urgentemente necessárias para acompanhar os dados biológicos de imagem. Embora os dados de imagem possam ser gerados em horas, a análise aprofundada das imagens leva muito tempo. Como resultado, o processamento de imagens tornou-se claramente um grande obstáculo em muitos campos. Isso se deve, em parte, à alta complexidade dos dados, especialmente quando se trata de amostras biológicas. Além disso, como muitos usuários não possuem habilidades especializadas de programação e processamento de imagens, ferramentas automatizadas que permitem o processamento de imagens sejam feitas de forma fácil e fácil de usar são necessárias. É por isso que espera-se que o SOA seja útil. Os resultados representativos demonstram a segmentação automatizada que permite a identificação dos ramos dendríticos na imagem em poucos passos simples, apesar da complexidade da rede dendrítica. O processo de trabalho é simples e intuitivo, e diversas informações espaciais são obtidas imediatamente e sem esforço. Vários algoritmos foram empregados para detectar ramos dendríticos individuais nas imagens de fluorescência e realizar múltiplas análises sobre os resultados. Uma descrição detalhada dos algoritmos pode ser encontrada no Material Suplementar e informações sobre os requisitos do sistema. Este artigo apresentará brevemente os algoritmos e seu papel no software.
Segmentação
A segmentação foi a parte mais desafiadora deste projeto. Na segmentação, uma imagem digital é convertida em vários segmentos (objetos de imagem). O objetivo da segmentação é identificar objetos na imagem e, assim, torná-los mais compreensíveis e disponíveis. Aqui, a segmentação foi utilizada para identificar ramos dendráticos e isolá-los a partir do fundo. O processo de segmentação de imagens foi dividido em duas etapas: a primeira etapa envolveu a detecção de ramos dendráticos como linhas, e a segunda etapa envolveu a fusão de linhas relacionadas com base nos critérios de distância e direção estabelecidos pelo usuário.
Informações e análises dendríticas
Foram coletadas informações sobre a localização, ângulo e comprimento de cada linha detectada. O software realiza as seguintes análises sobre os dados obtidos de todas as linhas identificadas na imagem: 1. Classificação de Ramo Dendrático (Paralelo/Não Paralelo) 2. Foi medido o comprimento médio dos ramos dendráticos paralelos versus não paralelos. 3. Medição de distribuição angular e exibição 4. Medição de distância entre ramos dendráticos paralelos
A interface de usuário do SOA permite que os usuários carreguem uma imagem a partir dos arquivos do computador. Também permite ajustes nas configurações de segmentação. Como cada imagem de rede dendrítica é única, sugerimos "mexer" com as configurações para alcançar a melhor segmentação possível. A interface do usuário permite a comparação das imagens originais e segmentadas e o monitoramento imediato do efeito de qualquer alteração nas configurações na segmentação.
Após modificar todas as configurações, o SOA cria a figura final da segmentação que mostra cada um dos ramos dendráticos identificados. O SOA gera gráficos das análises realizadas e um arquivo .xlsx com todos os dados.
A saída do SOA pode ser utilizada como ponto de partida para a entrada de ferramentas para análise suplementar. Por exemplo, agora estamos desenvolvendo um software que calcula o valor médio do paralelismo para dendritos que receberam vários tratamentos usando a saída SOA em um grande número de imagens.
Resumo
O SOA é uma ferramenta automatizada para identificação, segmentação e extração de informações morfológicas importantes a partir de imagens de redes complexas de linha 2D e possui uma interface fácil de usar e intuitiva. Neste trabalho, o uso do SOA foi introduzido através de um exemplo de análise de redes dendríticas. SOA pode ser usado para a análise de outros tipos de redes celulares 2D, como redes de diferentes células neurais e não neurais, estruturas complexas intracelulares como as geradas pelo citoesqueleto e redes não biológicas, por exemplo, nanotubos e muito mais. O SOA foi desenvolvido para um propósito muito específico, e é importante conhecer suas vantagens e limitações. As limitações do SOA incluem o fato de que ele só é adequado para análise de imagem 2D e não para análise de imagem 3D. O SOA só pode ser usado para analisar imagens com objetos semelhantes a linhas. Além disso, as informações obtidas a partir do software limitam-se às informações espaciais dos dendritos identificados e às análises específicas aqui descritas. Análises adicionais não são realizadas pelo SOA. As principais vantagens do software são sua simplicidade e simpatia pelo usuário. O software permite que imagens complexas sejam analisadas rapidamente e em alguns passos fáceis. Além disso, o SOA é flexível e prontamente ajustável; portanto, sua capacidade analítica pode ser expandida além da morfometria e ser benéfica para outras aplicações.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Orly Weiss pela preparação das imagens culturais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team. | 3.4.2 | a Python 2D plotting library |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | artist for matplotlib to display a scale bar |
| NumPy | The NumPy community. | 1.20.3 | fundamental package for scientific computing library |
| OpenCV | OpenCV team | 4.5.2.54 | Open Source Computer Vision Library |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1 (Community Edition) version | Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | manage the GUI |
| python | Python Software Foundation License | 3.9 version | |
| Qt Designer | The QT Company Ltd. | 5.11.1 version | |
| scipy | Community library project | 1.6.3 | Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering |
| Seaborn | Michael Waskom. | 0.11.1 | Python's Statistical Data Visualization Library. |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | Python module for creating Excel XLSX files |
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