Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Summary

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera aktiva kärnämne extrakt från larv steg 4 C. elegans och visualisera transkription verksamhet i ett in vitro system.

Abstract

Caenorhabditis elegans har varit ett viktigt modellsystem för biologisk forskning sedan det infördes 1963. C. elegans har dock inte utnyttjats fullt ut i den biokemiska studien av biologiska reaktioner med hjälp av dess kärnextrakt såsom in vitro-transkription och DNA-replikering. Ett betydande hinder för att använda C. elegans i biokemiska studier stör nematodens tjocka yttre nagelband utan att offra aktiviteten hos kärnextraktet. Medan flera metoder används för att bryta nagelbandet, såsom Dounce homogenisering eller ultraljudsbehandling, leder de ofta till proteininstabilitet. Det finns inga etablerade protokoll för att isolera aktiva nukleära proteiner från larva eller vuxen C. elegans för in vitro reaktioner . Här beskriver protokollet i detalj homogeniseringen av larvstadium 4 C. elegans med hjälp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator använder tryck för att långsamt tvinga djuren genom ett smalt mellanrum som bryter nagelbandet i processen. Balch homogenisators enhetliga konstruktion och exakta bearbetning möjliggör konsekvent slipning av djur mellan experimenten. Fraktionering av homogenatet som erhålls från Balch homogenisator ger funktionellt aktiva kärnextrakt som kan användas i en in vitro-metod för att analysera transkriptionsaktiviteten hos C. elegans.

Introduction

Den lilla, frilevande nematoden Caenorhabditis elegans är en enkel men kraftfull modellorganism för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor. Sedan introduktionen 1963 har nematoderna varit ovärderliga för att svara på frågor inom neurobiologi, metabolism, åldrande, utveckling, immunitet och ^genetik1. Några av djurets många egenskaper som gör det till en idealisk modellorganism inkluderar kort generationstid, effektiviteten av RNA-interferens, transparent kropp och de färdiga kartorna över både dess cellulära härstamning och nervsystem.

Medan nematodens bidrag till vetenskapen är enorma, har de underutnyttjats för att klargöra det eukaryota transkriptionssystemet, med det mesta av vår förståelse för dessa mekanismer som kommer från studier med kärnextrakt från jäst, fruktfluga och däggdjurscellkultur2. Det största hindret som avskräcker forskare från att utvinna funktionellt kärnextrakt är nematodens tuffa yttre nagelband. Detta exoskelett består av korslänkade kollagener, cuticlins, glykoproteiner och lipider, vilket gör C. elegans från larvstadium till vuxen ålder resistent mot proteinutvinning via kemiska eller mekaniska ^krafter3. Ett in vitro transkriptionssystem med C. elegans kärnextrakt utvecklades en gång men inte allmänt antogs på grund av systemets begränsade omfattning, och användningen av Dounce homogenizer för att förbereda extraktet kan leda till protein ^{instabilitet4,5}.

Till skillnad från det tidigare protokollet för kärnextraktisolering som använde en Dounce homogenisator för att bryta C. elegans, använder detta protokoll en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av två huvudkomponenter: en volframkarbidboll och ett rostfritt stålblock med en kanal uttråkad från ena änden till en annan. Balch homogenisator är laddad med volframkarbidbollen och täckt på vardera sidan för att försegla slipkammaren. Sprutor kan laddas på de två vertikala portarna som leder in i slipkammaren. När materialet överförs från en spruta till en annan genom slipkammaren tvingar trycket från sprutorna materialet genom ett smalt mellanrum mellan bollen och kammarens vägg. Detta långsamma och konstanta tryck bryter materialet tills det når en jämn storlek som lätt kan passera genom det smala gapet. Att tvinga C. elegans genom det smala gapet via ett konstant men ändå mjukt tryck bryter djuren öppna och släpper ut deras innehåll i den omgivande bufferten. Om du byter bollstorlekar skärps gapet ytterligare, de nyutgivna cellerna bryts och kärnorna frigörs i bufferten. Flera fall av centrifugering separerar kärnorna från resten av cellskräpet, vilket möjliggör insamling av ett rent kärnextrakt. Balch homogenisator föredras framför Dounce homogenisator av flera skäl: systemet kan hantera ett stort antal djur, vilket gör det möjligt att extrahera en hög mängd aktiva proteiner i ett enda försök; Den exakta bearbetningen av bollarna och stålblocket möjliggör konsekvent slipning mellan flera prover. det tunga stålblocket fungerar som en kylfläns och drar jämnt bort värme från slipkammaren, vilket förhindrar denaturering.

Efter isolering måste transkriptionsaktiviteten av kärnextrakt verifieras innan den används i några biokemiska experiment. Traditionellt mättes transkriptionsaktivitet med hjälp av radiomärkta nukleotider för att spåra och visualisera det nyligen syntetiserade RNA. Radioaktiv märkning kan dock vara betungande eftersom det kräver försiktighet vid användning och ^{bortskaffande6}. Tekniska framsteg gör det möjligt för forskare idag att använda mycket mindre skadliga eller besvärliga metoder för att mäta även små RNA-mängder med hjälp av tekniker som kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR)⁷. Här beskriver protokollet en metod för att isolera aktiva kärnextrakt från larvstadium 4 (L4) C. elegans och visualisera transkriptionsaktivitet i ett in vitro-system.

Protocol

1. Medieförberedelser

1. Förbered sterila lysogena buljongplattor (LB) och flytande medier enligt tillverkarens instruktioner.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 på en LB agar tallrik. Inkubera bakteriestrimmen vid 37 °C över natten.
3. Förvara E. coli OP50-streckplattan vid 4 °C efter inkubation. E. coli OP50-plattan kan förvaras säkert vid 4 °C i 2 veckor om den är insvept i parafilm för att förhindra fuktförlust.
4. Förbered 2 L nematodtillväxtmedier (NGM) med receptet i tabell 1.
   OBS: Nystatin är valfritt. Nystatin hjälper till att förhindra mögel, och andra svamp förorenar från att växa på NGM-plattorna. De stora plattorna med diametern 150 mm har större chans att fånga svampsporer när locket tas bort för hällning och sådd av E. coli OP50. Nystatin kan köpas förblandat i steril lösning från leverantörer på 10 000 enheter/ml eller köpas som sterilt pulver och blandas med sterilt vatten. Nystatin kan inte autoklaveras, och det kan inte heller filtreras effektivt. Uppmärksamhet på den aseptiska tekniken är avgörande samtidigt som man blandar en lösning av nystatin i labbet. Autoklav 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6.0 och 1 M _MgSO4 vid 121 °C i 15 min. Filter sterilisera kolesterol genom ett 0,22 μm filter efter att ha lösts upp i 95% etanol.
5. Efter att ha lagt reagenserna i media, häll NGM i fyrtio 150 mm Petri-rätter. Varje 150 mm skål kräver 50 ml för att fylla. Låt NGM-plattorna svalna över natten vid rumstemperatur.
6. Inokulera två koniska rör på 50 ml som innehåller 25 ml steril LB med E. coli OP50 från föregående streckplatta. Inkubera buljongen vid 37 °C i 24 timmar i en skakinkubator som hålls vid 200 varv/min.
   OBS: För konsistens, inokulera båda rören med samma enda koloni från streckplattan. Om detta visar sig svårt, inokulera 5 ml steril LB med en enda koloni i ett koniskt rör på 50 ml och inkubera kulturen i 16 timmar vid 37 °C i en skakinkubator som hålls vid 200 varv/min dagen innan NGM-plattorna förbereds. Förvara den färska vätskekulturen vid 4 °C i upp till två dagar. Inokulera de två 25 ml buljong med 25 μL flytande odling och inkubera under samma förhållanden som nämnts ovan.
7. Frö färska NGM-plattor med 1 ml färsk E. coli OP50 flytande kultur och sprid med en flamsteriliserad spridare jämnt över plattans yta aseptiskt för att skapa en stor bakteriegräsmatta som täcker större delen av plattan, var noga med att inte sprida bakterierna från kant till kant. Låt E. coli OP50 växa i rumstemperatur i 72-96 timmar eller tills en synligt tjock gräsmatta visas.
   OBS: Efter 24 timmar, flytta de nysådda NGM-plattorna till en täckt behållare för att minska fuktförlusten och förlänga plattornas livslängd.

2. Djurpreparat och blekmedelssynkronisering

1. Överför 5 välmatade, vilda, gravida vuxna C. elegans till var och en av de 10 färska NGM-plattorna sådda med E. coli OP50, för totalt 50 djur.
2. Låt djuren lägga ägg. Låt avkomman växa vid 20 °C tills de når det gravida vuxenstadiet.
3. Använd 15 ml M9-buffert (tabell 2) för att samla in de nya välmatade vilda, gravida vuxna från de tio underhållsplattorna och överföra djuren till ett märkt koniskt rör på 15 ml.
4. Centrifugera djuren på 1 000 x g i 3 minuter för att pelletera alla djur längst ner i röret.
5. Blanda 2 ml blekmedel med 5 ml 1 N NaOH för blekmedelssynkronisering i ett separat, märkt koniskt rör på 15 mL. Vortex lösningen för att blanda noggrant.
   OBS: Använd blekmedel + NaOH-lösningen samma dag som den är beredd att vara effektiv.
6. Ta försiktigt bort supernatanten från de centrifugerade djuren med en 10 ml steril pipett. Försök att ta bort så mycket M9-buffert som möjligt för att förbättra djurbrottet.
7. Tillsätt 500 μL av blekmedlet + NaOH-lösningen till djurpelleten och starta en timer i 4 min.
8. Antingen för hand eller med en vipp, gunga försiktigt röret för att bryta djurpellet helt och låt djuren röra sig fritt i blekmedlet + NaOH-lösningen. Fortsätt att gunga röret under hela 4 min varaktighet.
   OBS: Mängden blekmedel + NaOH-lösning som behövs kan variera beroende på storleken på den djurpellet som synkroniseras. Optimera denna teknik i förväg med varierande mängder djur och blekmedel + NaOH-lösning.
9. Kontrollera brytande effektivitet under ett dissekeringsmikroskop efter 4 minuter. Se till att en majoritet av de gravida vuxna djuren bryts och att deras inre innehåll frigörs, inklusive äggen.
10. Om djuren inte är uppsplittring, virvla röret kort med maximal hastighet och kontrollera sedan igen under mikroskopet.
    OBS: Medan äggen är resistenta mot blekmedlet + NaOH-lösningen är de inte ogenomträngliga. Ägg får inte utsättas för blekmedel + NaOH-lösningen längre än nödvändigt. Att stanna för länge under djurbrottet kan leda till utvecklingsproblem för avkomman.
11. Tillsätt 10 ml M9-bufferten till den trasiga djurlösningen.
12. Centrifugera äggen och resterna vid 1 000 x g i 3 min.
13. Pipettera bort supernatanten och se till att inte röra vid den nya pelleten som innehåller alla ägg längst ner på röret.
14. Tillsätt ytterligare 10 ml M9-bufferten och centrifugera igen i 3 min vid 1 000 x g.
15. Upprepa steg 2.13-2.14 ytterligare två gånger för att säkerställa att ingen blekmedel + NaOH-lösning finns kvar.
16. Efter den tredje M9-bufferttvätten tar du bort supernatanten och lägger till 10 ml S-basalbufferten (tabell 2).
17. Vänd röret för att bryta pelleten längst ner för att suspendera äggen lika i bufferten.
18. Placera röret på en vipp och gunga försiktigt röret i 22 timmar vid 20 °C så att äggen kan kläckas och nå larvstadium 1 (L1) gripande.
19. Efter 22 h, centrifugera röret som innehåller synkroniserade L1-djur i 3 min vid 1000 x g.
20. Pipettera och kassera supernatanten och lämna cirka 1 ml buffert i röret.
21. Med hjälp av en mikropipette, stör djurpelleten för att göra en homogen suspension av L1-djur i den återstående bufferten.
22. Överför en enda droppe av den homogena suspensionen av L1-djur till en märkt 150 mm NGM-platta sådd med E. coli OP50.
23. Beräkna djurtätheten per droppe genom att visuellt räkna antalet L1-djur per droppe med hjälp av ett dissekeringsmikroskop. En 150 mm NGM-platta med en fullvuxen gräsmatta av E. coli OP50 kan stödja upp till 500 djur i L1-stadiet för att nå det gravida vuxenstadiet.
24. Överför L1-djuren till sex 150 mm NGM-plattor med E. coli OP50. Se till att plattan inte överbelastas.
    OBS: Om det är oklart om djuren kommer att ha tillräckligt med mat för utveckling mellan L1 och gravid vuxen, tillsätt färre djur till varje tallrik och använd fler tallrikar.
25. Låt djuren växa i 72 timmar vid 20 °C tills de når gravid vuxenstadiet och börjar lägga ägg.
26. Utför en andra omgång blekmedelssynkronisering på de synkroniserade, välmatade gravida vuxna djuren av vild typ.
27. Placera de synkroniserade L1-djuren på tio 150 mm NGM-plattor sådda med E. coli OP50, med cirka 1 000 djur per tallrik.
28. Låt de nya synkroniserade L1-djuren växa i 48 timmar vid 20 °C tills de når L4-stadiet.
    OBS: Målet är att få en cirka 700 - 800 μL pellet av L4 djur. För många djur kan göra det svårt att använda Balch homogenisator; detta kan leda till muskelbelastning när homogenisatorn används och eventuellt läckage från sprutorna på grund av det ökade trycket.

3. Balch homogenisatorberedning

1. Förbered både hypotona och hypertona buffertar enligt tabell 3 och tabell 4.
   OBS: De hypotona och hypertona buffertarna kan beredas i förväg och förvaras säkert vid 4 °C.
2. Rengör Balch homogenisatorn genom att översvämma slipkammaren med 70% etanol och skölj sedan kammaren med avjoniserat vatten för att avlägsna överskott av etanol.
   OBS: Undvik att använda frätande medel för att rengöra Balch homogenisator. Noggrann sköljning med etanol och avjoniserat vatten bör vara tillräckligt för att rengöra det.
3. För in volframkarbidkulan med 7,9820 mm (18 μm mellanrum) i slipkammaren.
4. Kapa varje ände av balch homogenisatorns pipa och fäst locken med de medföljande tumskruvarna.
5. Förbered 5 ml "fullständig hypotonbuffert" per prov: Tillsätt 5 μL 1 M DTT (slutlig koncentration: 1 mM DTT) och 100 μL 100x proteashämmare, engångscocktail (slutlig koncentration: 2x). Håll bufferten på is.
6. Förbered 5 ml "fullständig hypertonbuffert" per prov: Tillsätt 5 μL 1 M DTT (slutlig koncentration: 1 mM DTT) och 100 μL 100x proteashämmare, engångscocktail (slutlig koncentration: 2x). Håll bufferten på is.
   OBS: Använd den kompletta hypotona och hypertona bufferten samma dag som tillagningen. Förvara den inte för senare användning. Förvara 1 M DTT som engångs alikvoter vid -20 °C. Förvara proteashämmarens engångscocktail vid 4 °C.
7. Fyll en steril 2 ml-spruta med 1 ml "komplett hypotonbuffert" och spola försiktigt slipkammaren i Balch homogenisator. Lämna cirka 500 μL "fullständig hypotonbuffert" i kammaren.
8. Förvara den spolade homogenisatorn på is och låt den svalna i 30 minuter.
   OBS: Homogenisatorn måste vara iskall innan djuren mals. Slipprocessen kan producera värme på grund av friktion och denatur av kärnproteinerna. Se till att metall homogenisatorn är iskall för att förhindra att detta händer. Var noga med att undvika att vatten från den omgivande isen kommer in i homogenisatorn. Använd två sterila sprutor för att täppa till hålen i homogenisatorn och blockera oavsiktliga vätskor från att komma in i slipkammaren.

4. Insamling av djur

OBS: En snabbreferensguide tillhandahålls som markerar de viktigaste stegen för insamling, störning och fraktionering av djuren (figur 1).

1. Samla de välmatade L4-djuren med M9-buffert i ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera djuren vid 1000 x g i 3 min. Ta bort supernatanten och fortsätt att tvätta djurpelleten tills supernatanten är klar.
2. Tvätta djuren med 3 ml 4 °C hypotonbuffert och centrifugera igen vid 1000 x g i 3 min.
   OBS: Under den slutliga tvätten med hypotonbufferten på 4 °C kan djuren fastna på sidan av röret. Detta är normalt och kan leda till en liten förlust av djur under avlägsnandet av supernatanten.
3. Ta bort hypotonbufferten och tillsätt 1 ml "fullständig hypoton buffert" till djurpelleten. Överför djursuspensionen till en ny 2 ml steril spruta.
   OBS: När du överför djuren till sprutan med en mikropipette, rör försiktigt en steril 0,1% Tween20-lösning för att täcka insidan av pipettens spets för att minska antalet djur som går förlorade på grund av att de fastnar på pipettspetsväggarna.

5. Fraktionering

1. På is homogenisera djuren genom att försiktigt trycka djuren genom slipkammaren på Balch homogenisator laddad med 7,9820 mm kula och i en ny steril spruta. Upprepa att man trycker djuren genom slipkammaren i 30 kompletta cykler.
   OBS: En "komplett cykel" definieras som den fullständiga upp- och nedrörelsen för en sprutas kolv.
   Detta slipsteg använder 7,9820 mm kula (18 μm kullager).
2. Efter 30 cykler, ta bort så mycket av djurfjädringen som möjligt från Balch homogenisator och förvara sprutan, tippa ner i ett 1,7 ml mikrorör.
3. Ta bort 7,9820 mm kulan från slipkammaren och rengör den med avjoniserat vatten. Torka och sätt tillbaka bollen i dess märkta rör.
4. För in kulan på 7,9880 mm (12 μm mellanrum) i slipkammaren och återförslut homogenisatorn.
5. Spola slipkammaren igen med 1 ml iskall "komplett hypotonbuffert".
6. Slipa fjädringen i 25 kompletta cykler.
7. Efter 25 cykler, ta bort djurfjädringen från Balch homogenisator, överför suspensionen till en ren 1,7 ml mikrorör och förvara den på is.
   OBS: Demontera och rengör Balch homogenisator med 70% etanol och avjoniserat vatten. Var noga med att återföra 7,9880 mm kulan till rätt rör.
8. Pellet djurkropparna och skräpet genom att centrifugera suspensionen vid 500 x g, 4 °C i 5 min.
9. Pipett 40 μL av supernatanten till ett rör märkt "ingångsfraktion" och förvara det på is.
   OBS: Skriv alla etiketter med en alkoholsäker penna för att undvika att smutsa ner dem senare.
10. Överför den återstående supernatanten till ett nytt 1,7 ml-rör, var noga med att undvika att röra pelleten längst ner i röret och kassera sedan pelleten.
11. Centrifugera supernatanten för att pelletera kärnorna vid 4 000 x g, 4 °C i 5 min.
12. Överför supernatanten, var försiktig så att du inte stör de pelleterade kärnorna, till ett nytt 1,7 ml-rör och märk röret som "cytosolisk fraktion".
    OBS: Centrifugera den cytosolutiska fraktionen ytterligare vid 17 000 x g, 4 °C i 30 minuter för att avlägsna kvarvarande olösligt material och använd det som en negativ kontroll för västerländska fläckar (särskilt för kärnproteiner).
13. Tvätta nukleipellets med 500 μL "komplett hypotonbuffert" och överför pelleten till ett nytt 1,7 ml-rör. Centrifugera den upphängda pelleten vid 4 000 x g, 4 °C i 5 min.
14. Kassera supernatanten och tillsätt 500 μL färsk "fullständig hypotonbuffert" till kärnpelleten och överför suspensionen till ett nytt 1,7 ml-rör. Centrifugera provet igen vid 4 000 x g, 4 °C i 5 min.
15. Ta bort överanten och lös upp pelleten i 40 μL "fullständig hypertonbuffert". Överför den nya kärnavstängningen till ett nytt 1,7 ml-rör, märk röret som "kärnfraktion" och förvara det på is.
16. Bestäm proteinkoncentrationen för de tre fraktionerna med hjälp av ett fluorescerande kvantifieringskit.
    OBS: Mängden kärnprotein som förvärvas från denna metod kan variera från 1-2 μg/μL.
17. Aliquot kärn- fraktioner in i singel-brukrör som innehåller 6 μg av kärn- proteinet och knäpp frysa i en torr is och etanolbad. Förvara vid -80 °C tills vidare användning.

6. Transkriptionsanalys

1. Slå på och förvärm ett värmeblock till 30 °C.
2. Ta bort följande från Nulcear Extract in vitro transkriptionssystem: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP och CMV promotorn positiv kontroll mall. Tina på is.
   OBS: Förstärk DNA-mallen för positiv kontroll med hjälp av ett polymeras med hög återgivning och förvara det som normaliserade engångs alikvoter.
3. Blanda och centrifugera de tinade rNTP:erna innan du förbereder en arbetslösning på 10 mM.
   OBS: Tillsätt 2 μL av varje rATP, rCTP, rGTP och rUTP till 12 μL _H2O för att uppnå 10 mM av varje rNTP. Denna komposition kan skalas upp om det behövs.
4. Aliquot rNTP-blandningen till märkta engångsrör och förvara vid -20 °C för framtida användning.
5. Tillsätt reagenserna per reaktion enligt tabell 5 i ett färskt 1,5 ml-rör märkt "Mastermix"
6. Överför 14 μL av Mastermix till varje reaktionsrör
7. Tillsätt 11 μL minus (volym för 5 μg av kärnextraktet) av 1x Transkriptionsbuffert till varje reaktionsrör.
8. Tillsätt 5 μg av kärnextraktet till varje reaktionsrör.
9. Knacka försiktigt på reaktionsröret för att blanda innehållet inuti och pulsera centrifugera rören efter blandning för att säkerställa att inget reaktionsmaterial fastnar på rörens vägg.
10. Inkubera reaktionerna vid 30 °C i 30 min.
11. Stoppa omedelbart reaktionen genom att tillsätta 400 μL RLT-buffert som tillhandahålls av RNA-extraktionssatsen.
    OBS: Vid denna tidpunkt är det säkert att stanna. Proverna kan förvaras vid -80 °C tills de rengörs ytterligare med RNA-extraktionssatsen.

7. RNA städa upp

1. Förbered DNase I-lagerlösningen med den RNase-Fria DNase-uppsättningen som finns i RNA-extraktionssatsen. Lös upp den frystorkade DNase I i 550 μL RNase-fritt vatten. Blanda försiktigt lösningen. Virvla inte . Aliquot DNase I-lösningen i 10 μL engångsrör och förvara alikvoterna vid -20 °C.
2. Förbered 70% och 80% etanol med molekylär etanol och RNase-fritt vatten.
3. Flytta proverna och reagenserna till en RNase-fri arbetsyta innan du påbörjar rensningen.
4. Tillsätt 400 μL 70% etanol till varje prov och rör försiktigt för att blanda väl.
5. Överför 400 μL av provet till en märkt RNA-extraktionsspinnkolonn med ett uppsamlingsrör på 2 ml och centrifugera provet vid 8 500 x g i 30 s. Kassera genomströmningen.
6. Upprepa steg 7.5 med det återstående provet och kasta igenom flödet.
7. Tillsätt 350 μL RW1-buffert (RNA-extraktionssats) till varje kolumn. Centrifugera kolonnerna vid 8 500 x g i 30 s. Kassera genomströmningen.
8. Tillsätt 70 μL RDD-buffert (RNA-extraktionssats) till en enda 10 μL alikvot DNase I-lagerlösning och blanda försiktigt. Virvla inte.
9. Tillsätt DNase I inkubationsblandningen (80 μL) direkt till spinnkolonnmembranet. Inkubera kolonnerna vid rumstemperatur i 15 min.
   OBS: Var noga med att tillsätta DNase I-lösningen i membranet. Undvik att förlora en del av lösningen till pelarväggen eller O-ringen.
10. Efter 15 min, tillsätt 350 μL RW1-buffert till kolumnerna. Centrifugera i 30 s vid 8 500 x g. Kassera genomströmningen.
11. Placera kolonnerna i nya 2 ml uppsamlingsrör. Tillsätt 500 μL RPE-buffert (RNA-extraktionssats) i centrifugeringskolonnen. Centrifugera kolonnerna vid 8 500 x g i 30 s för att tvätta membranet. Kassera genomströmningen.
12. Tillsätt 500 μL 80 % etanol till varje kolumn och centrifugera kolonnerna vid 8 500 x g i 30 s. Kassera genomströmningen.
13. Placera kolonnerna i nya 2 ml uppsamlingsrör. Lämna kolonnlocken öppna och centrifugera kolonnerna på 17 900 x g i 5 minuter. Kassera genomströmningen.
14. Placera kolonnerna i märkta 1,7 ml-rör. Tillsätt 17 μL RNase-fritt vatten direkt i mitten av spinnkolonnmembranet. Låt kolonnerna vila i rumstemperatur i 1 min. Centrifugera kolonnerna vid 17 900 x g i 1 min.
15. Kassera kolonnen och behåll 1,7 ml-röret med det nyrenade RNA-provet.

8. DNA-matsmältning

1. Förvärm två värmeblock vid 37 °C och 65 °C.
2. Tillsätt 2 μL 10x reaktionsbuffert till varje prov.
3. Tillsätt 1 μL (1 MBU) DNase till varje prov.
4. Ställ in en pipett på 10 μL och pipetten den nya lösningen upp och ner för att blanda försiktigt. Virvla inte.
5. Inkubera RNA-proverna vid 37 °C i 30 minuter för att smälta eventuellt återstående DNA.
6. Inaktivera DNase genom att inkubera proverna på värmeblocket vid 65 °C i 10 minuter.
   OBS: Det är säkert att stanna vid detta steg och lagra RNA vid -80 °C för att utföra omvänd transkription senare.

9. Omvänd transkription

1. När du programmerar termocykeln, tillsätt ytterligare 1 h, 37 °C steg före inkubation för att förvärma termocykeln. Kör programmet med "förvärmningssteget" medan du förbereder proverna och låt termocykeln nå 37 °C. När proverna för omvänd transkription är klara hoppar du över 37 °C förvärmningssteget och fortsätter till det faktiska inkubationssteget (tabell 6). Om termocykeln inte har en skipfunktion, lägg till ett steg på 1 min 37 °C före inkubation. Låt termocykeln värmas upp till rätt temperatur innan du pausar systemet och lägger till de beredda proverna.
2. Förbered en 10 μM arbetslösning för transkriptionsvänd primer i RNase-fri _H2O och förvara den på is.
3. Tina på is, 10x buffert från omvänd transkriptionssats, dNTP-blandning (5 mM varje dNTP), RNase Inhibitor och omvänd transkriptas.
4. Förbered en Mastermix (per reaktion) genom att tillsätta de beståndsdelar som nämns i tabell 7 i ett rent 0,2 ml PCR-rör.
5. Aliquot 18 μL av Mastermix i nya 0,2 ml PCR-rör för varje prov.
6. Tillsätt 2 μL av DNase-behandlat RNA för varje prov i deras respektive märkta rör.
7. Inkubera proverna vid 37 °C i 1 h i en förvärmd termocykel.
8. Flytta exemplen till -20 °C för lagring efter omvänd transkription eller fortsätt direkt till nästa steg.
   OBS: Det är säkert att stanna vid detta steg; förvara cDNA vid -20 °C för senare användning.

10. Specifik produktförstärkning

1. Tina på is: cDNA, 10 μM transkription framåt och 10 μM transkription omvända primers, och PCR 2x Premix A.
   OBS: Aliquot PCR 2x Förblandning A i mindre volymer för att minska upptiningstiden.
2. Skapa en Mastermix (per reaktion) genom att lägga till de beståndsdelar som nämns i tabell 8 i ett rent 0,2 mL PCR-rör.
3. Alikvot 24 μL Mastermix för varje prov i rena 0,2 mL PCR-rör.
4. Tillsätt 1 μL cDNA av varje prov i sina respektive rör.
5. Inkubera proverna i termocykeln med hjälp av de programvillkor som anges i tabell 9
6. Efter inkubationen förvarar du PCR-produkterna vid 4 °C eller -20 °C för långtidslagring.

11. Gelanalys

1. Använd 1x TAE-buffert för att bereda en gel som innehåller 2% w/v agaros och 1x gelfläck.
2. Kör PCR-produkterna på 50 V och 300 mA i 1 h eller tills det finns en tydlig bandseparation.
3. Avbilda gelén med hjälp av det automatiska exponeringsprogrammet förinstallerat i gelbildaren.

Representative Results

Enligt de skisserade stegen bör ge funktionellt kärnextrakt (figur 1) kan avvikelse i slip- eller tvättstegen leda till dålig aktivitet eller låg avkastning. Om funktionellT C. elegans kärnextrakt erhålls kommer det att transkribera regionen nedströms CMV-promotorn på DNA-mallen när den läggs till i den tidigare beskrivna in vitro-analysen . Den resulterande RNA-transkriptionen kan renas från kärnproteinerna och DNA-mallen med konventionella metoder. Utan mallen DNA kan omvänd transkription och efterföljande PCR-produkt endast vara resultatet av RNA som transkriberas av kärnextraktet. PCR-produkterna kan visualiseras på en agarosegel, intensiteten i DNA-bandet kan vara vägledande för kvaliteten på kärnprotein och RNA-isolering. En svag bandintensitet kan orsakas av inaktivering av kärnextraktet antingen av värme eller dålig buffertberedning. En alltför stark bandintensitet kan vara resultatet av DNA-förorening antingen på grund av dålig RNA-rening eller felaktig DNase-matsmältning. Konsekventa och framgångsrika kärnisoleringar kommer att ge band med liknande intensiteter, och både transkriptions- och PCR-negativa kontroller bör inte ha någon synlig PCR-produkt (figur 2).

Figur 1. En skiss av kärn- extrakt isolering. Flödesschemat beskriver de viktigaste stegen för att isolera kärnextrakt från C. elegans. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2. C. elegans kärnextrakt behåller sin verksamhet. Gel bilden visar transkription produkter av C. elegans L4 larver kärnextrakt med hjälp av CMV promotorn DNA mall. Framgångsrik isolering av aktiva nukleära proteiner kommer att resultera i en 132 bp PCR produkt efter in vitro transkription, som ses i körfält 1 och 2. Misslyckad isolering resulterar i ett svagt band eller frånvaron av en PCR-produkt som liknar bana 3. Denna visualisering av transkriptionsaktiviteten via PCR-förstärkning är ett enkelt sätt att bedöma kvaliteten på isoleringen av kärnutvinning. Den positiva PCR-kontrollen produceras genom att lägga till CMV-promotorns DNA-mall till PCR-reaktionen, och den negativa kontrollen saknar mall-DNA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Nematode Tillväxt Media Plattor
Agar	20,4 g
Koksalt	2,8 g
Bacto pepton	2,3 g
dH2O	975 ml
Autoklav vid 121 °C i 30 min
Låt mediet svalna till 50 °C innan du lägger till följande
1 M CaCl2 (Steril)	1 ml
1 M MgSO4 (Steril)	1 ml
10 000 enheter/mL Nystatin (steril)	3 ml
5 mg/ml kolesterol i 95% etanol (Filter steriliserat)	1 ml
1M KPO4 pH 6.0 (Steril)	25 ml

Tabell 1.

M9-buffert
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1 000 ml
Autoklav vid 121 °C i 15 min
1 M MgSO4 (Steril)	1 ml (lägg till efter autoklavering)
S-basal buffert
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1 000 ml
Autoklav vid 121 °C i 15 min
Kolesterol 5 mg/ml (sterilt)	1 ml (lägg till efter autoklavering)

Tabell 2.

Hypoton buffert
Lagerlösning	Volym	Slutlig koncentration
1 M HEPES KOH pH 7,6	7.5 ml	15 mM
1 M KCl	5.0 ml	10 mM
1 M MgCl2	2.5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0.1 ml	0,1 mM
1 M Sackaros	175 ml	350 mM
dH2O	309.9 mL
Filtersterilisering

Tabell 3.

Hyperton buffert
Lagerlösning	Volym	Slutlig koncentration
1 M HEPES KOH pH 7,6	7.5 ml	15 mM
1 M KCl	200 ml	400 mM
1 M MgCl2	2.5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0.1 ml	0,1 mM
10% Interpolering 20	5 ml	0.10%
50% Glycerol	100 ml	10%
dH2O	184,9 mL
Filtersterilisering

Tabell 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
rNTP mix, 10 mM vardera	1.0 μL
Mall DNA, 25 ng/μL	4.0 μL
RNase-fri H2O	7,5 μL

Tabell 5.

Steg	Vikarie	Tid	Cykelnummer
Förvärma	37 °C	60 min	1x
Omvänd transkription	37 °C	60 min	1x
Hålla	10 °C		1x

Tabell 6.

10x omvänd transkriptionsbuffert	2.0 μL
dNTP Mix (5 mM varje dNTP)	2.0 μL
Transkription omvänd primer (10 μM)	2.0 μL
RNase-hämmare	1.0 μL
Sensiscript omvänd transkriptas	1.0 μL
RNase-fri H2O	10.0 μL

Tabell 7.

RNase-fri H2O	6.25 μL
Transkription Framåt Primer (10 μM)	2,5 μL
Transkription omvänd primer (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Förblandning A	12,5 μL
PCR enzym blandning	0.25 μL

Tabell 8.

Steg	Vikarie	Tid	Cykelnummer
Första protesen	92 °C	60 s	1x
Denaturera	92 °C	30 s
Härda	59 °C	30 s	35x
Förlängning	72 °C	30 s
Hålla	10 °C		1x

Tabell 9.

Discussion

C. elegans är en tilltalande modellorganism för att studera det eukaryota transkriptionssystemet på grund av dess billiga underhåll och den enkla genetiska manipulationen. Här beskrivs ett protokoll för konsekvent isolering av funktionellt aktiva kärnämne extrakt från L4 C. elegans . Även om detta protokoll fokuserade på att visualisera transkription verksamhet, cDNA produceras post-transcriptionally kan kvantifieras med RT-qPCR för att få en mer exakt mätning av transkription ^verksamhet8. Denna metod för att isolera nukleära proteiner från C. elegans kan hjälpa till att utöka studien av eukaryota transkriptionsmaskineri. Eftersom C. elegans inte är en kultur av celler i en maträtt eller en koloni av jäst utan snarare ett fritt strövande djur, kan isolering och forskning om dess kärnextrakt ge en tydligare inblick i hur transkriptionsmaskineriet kan förändras över tid eller i olika miljöer. Detta gör det möjligt för forskare att dra nytta av C. elegans låg kostnad och motståndskraft. C. elegans, till skillnad från andra modellorganismer eller cellkulturer, är mycket mer förlåtande när bakteriell eller jästförorening uppträder. En population av C. elegans kan enkelt rengöras från förorening med hjälp av etablerade protokoll, vilket sparar tid och ansträngning när förorening ^inträffar9. Sammantaget, använda kärnämne extrakt från C. elegans för biokemiska analyser kan vara ett mer överkomligt och flexibelt alternativ jämfört med att köpa kärnextrakt från en leverantör eller hantera mindre förlåtande modellorganismer.

Även om detta protokoll är relativt enkelt, finns det fortfarande kritiska steg som kräver särskild uppmärksamhet för en framgångsrik isolering av kärnextraktet. Det är viktigt att de två lösningarna är tydligt märkta och separerade under beredningen av de kompletta hypotoniska och hypertona buffertarna. Om buffertarna byts ut någon gång under isoleringen kan detta leda till inaktivering av kärnproteinerna eller dålig fraktionering av de cytosoliska proteinerna från kärnproteinerna. Isolerade nukleära proteiner bör också vid behov spädas ut i hypertonbuffert, inte vatten eller någon annan lösning. Den höga saltkoncentrationen hjälper till att bevara proteinernas aktivitet, och en hypoton lösning kan döda denna ^aktivitet10.

En annan utmaning som kan uppstå under slipdelen av detta protokoll kommer från skräp som följer upp till ytan av volframbollarna. Medan det anges att bollarna ska tvättas och torkas efter varje slipningscykel, kommer materialet att fästas på bollarnas släta yta. Detta material visas vanligtvis som rostfärgade ringar runt bollarnas omkrets och är tillräckligt tjockt för att blockera gapet mellan bollen och väggen i slipkammaren. Denna blockering är märkbar eftersom det blir allt svårare att driva djuren genom kvarnen, vilket så småningom kan leda till muskelskada eller bristning av sprutan. Om volframbollarna börjar visa missfärgning, blötlägg dem i varmt vatten i 5 minuter och rengör sedan ytan med en ny skurplatta. Undvik att använda sura eller grundläggande rengöringslösningar. Efter försiktigt polering bör volframbollarna återgå till sin ursprungliga glans, och det blir märkbart lättare att mala prover.

Detta protokoll är utformat för att isolera hela kärnextrakt från C. elegans. Det har inte testats för användning på andra modellorganismer. Kärnextrakt från andra organismer kan kräva olika buffertar, och CMV-promotorn kanske inte räcker för att driva transkription i andra prover som inte är däggdjur. Det nukleära extrakt som samlas in med denna metod är inte heller vävnads- eller cellspecifikt. All transkriptionsaktivitet som mäts med denna metod tittar på djuren som helhet och som kan dölja de subtila förändringarna mellan vävnaderna.

Framtida användning av detta protokoll kan mäta DNA-reparations- eller replikeringsmaskineriet för C. elegans efter DNA-skador. Den cytosoliska fraktion som samlats in under isoleringsprocessen kan användas för att mäta mängden lösliga proteiner och kvantifiera aktiviteten hos dessa proteiner på ett sätt som liknar mätning av transkription.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010