Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/62913
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

Summary

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

Abstract

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ולמוגבלות ברחבי העולם. רפרטפוזיה גורמת לפציעה נוספת מעבר לאיסכמיה. תאי אנדותל (ECs) יכולים להגן על קרדיומיוציטים (CMs) מפני פגיעה ברפרטוזיה באמצעות אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבויות משותפות יכולות לעזור לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבות משותפת מעורבת היא הגישה הפשוטה ביותר, אך מוגבלת מכיוון שטיפולים מבודדים וניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים בודדים אינם אפשריים. כדי לחקור אם ECs יכול למנות תלוי מינון להחליש נזק לתאי CM והאם הגנה זו יכולה להיות ממוטבת עוד יותר על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התאים, השתמשנו בתאי אנדותל עורק הכלילי הראשי של העכבר הראשי ובקרדיומיוציטים של עכבר בוגר כדי לבדוק שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים שהשתנו במרחק השכבה הבין-תאית שלהם ב- 0.5, 1.0, ו 2.0 מ"מ, בהתאמה. ב- CMs בלבד, פגיעה תאית כפי שהוערכה על ידי שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) גדלה באופן משמעותי במהלך היפוקסיה ובהמשך על reoxygenation כאשר המרחק היה 2.0 מ"מ לעומת 0.5 ו 1.0 מ"מ. כאשר ECs וCMs היו במגע כמעט ישיר (0.5 מ"מ), היה רק החלקה קלה של פגיעה reoxygenation של CMs בעקבות היפוקסיה. הנחתה זו הוגדלה באופן משמעותי כאשר המרחק המרחבי היה 1.0 מ"מ. עם מרחק של 2.0 מ"מ, ECs החלישו פגיעת CM במהלך היפוקסיה והיפוקסיה / reoxygenation, המציין כי התרחקות תרבותית מספקת נחוצה עבור ECs כדי להצליב עם CMs, כך מולקולות אות מופרש יכול להסתובב ולעורר באופן מלא מסלולי הגנה. הממצאים שלנו מראים, בפעם הראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת EC / CM נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של ECs בהגנה CM מפני איסכמיה מדומה / פגיעה reperfusion. מטרתו של דו"ח זה היא לספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

Introduction

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם 1,2. עם זאת, תהליך הטיפול של רפרטפוזיה יכול עצמו לגרום למוות cardiomyocyte, המכונה איסכמיה שריר הלב / רפרטפוזיה (IR) פגיעה, אשר עדיין אין תרופה יעילה3. תאי אנדותל (ECs) הוצעו להגן על cardiomyocytes (CMs) באמצעות הפרשת אותות paracrine, כמו גם אינטראקציות תא לתא4.

מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות אוטוקרין ו/או פראקרין תא-תא על תפקוד התא וההבחנה. בין מודלים של תרבות משותפת, תרבות משותפת מעורבת היא הפשוטה ביותר, שבה שני סוגים שונים של תאים נמצאים במגע ישיר בתוך תא תרבות יחיד ביחס התא הרצוי5. עם זאת, טיפולים נפרדים בין סוגי תאים וניתוח במורד הזרם של סוג תא יחיד אינם אפשריים בקלות בהתחשב באוכלוסייה המעורבת.

מחקרים קודמים הצביעו על כך עלבונות היפוקסיים ואיסכמיים לגרום נזק משמעותי לשלמות של קרום התא כפי שנמדד על ידי שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH). פציעה זו מחמירה עם reoxygenation, מחקה פגיעה reperfusion 6,7,8. מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה לבדוק את ההשערות כי נוכחותם של רדיקלים אלקטרוניים יכולה להחליש באופן תלוי במינון דליפת קרום התא של CMs הנגרמת על ידי היפוקסיה ו reoxygenation (HR) וכי ההשפעה המגנה של ECs ניתן למטב על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התא. לכן, העסקנו שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים ותאי אנדותל עורקים כליליים עיקריים עכבר ו Cardiomyocytes עכבר מבוגר. התוספות, ממותגות על ידי קורנינג, מרק מיליפור, ו Greiner Bio-One אפשרו לנו ליצור שלושה תנאים שונים של תרבית תאים צולבת עם מרחקי קו בין תאים של 0.5, 1.0 ו -2.0 מ"מ, בהתאמה. 100,000 ECs היו מצופים לכל הוספה בכל מקרה.

בנוסף, על מנת לקבוע אם הצפיפות של ECs בתרבות משותפת תורמת להחלשת פגיעה במשאבי אנוש במודל זה, חקרנו את יחסי תגובת המינון בין ריכוז EC לשחרור LDH על ידי CMs. ECs היו מצופים ב 25,000, 50,000 ו 100,000 לכל הוספה, בהתאמה, בתוספת 2.0 מ"מ.

דו"ח זה מספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה/ציפוי ניסיוני

  1. שמור על CMs ו- ECs בהתאם להוראות היצרן.
    1. להפשיר את שני קווי התא כאשר הם מגיעים מספקים. צלחת בבקבוקונים T25 לאחר שטף עם מדיה טרייה. מומלץ לרכוש כל מדיה של תרבית תאים מאותם ספקים שמהם נרכשו התאים. למחרת, רענן את התאים עם מדיה והשתמש כאשר הם נפגשים.
    2. לשמור על אינקובטור תרבית התא ב 37 °C (37 °F) עם 21% O2, 5% CO2, 74% N2 ולשמור אותו לח.
      הערה: תאי אנדותל העורק הכליליים העיקריים המשמשים בפרוטוקול זה מבודדים מעורקים כלילית של עכברי C57BL/6, וקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים מבודדים מלבבות עכבר C57BL/ 6J בוגרים ומתקבלים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).
  2. לוחות CMs בתנאים סטריליים על החלק התחתון של לוחות 24 בארות (שכבה נחותה). 24 שעות מאוחר יותר, צלחת ECs לתוך הכנס (או חלק מעולה) של התרבות המשותפת היטב. 24 שעות לאחר ציפוי EC, מקם תוספות EC על בסיס לוח CM, החל את תקופת התרבות המשותפת. אפשר לתאים להתאים לתרבות משותפת למשך 12-24 שעות לפחות לפני השימוש. שלבים אלה מתוארים בפירוט להלן.
    1. הערכת מפגש קו תא CM תחת מיקרוסקופ אור. כאשר תאים נראים 90%-100% מפגש בבקבוקי תרבות, להמשיך עם ציפוי ניסיוני.
    2. הסר את המדיה מן הבקבוקונים המכילים תרביות תאים בולווים ו trypsinize עם 3-5 מ"ל של חומצה טריפסין / אתילנדימינטטטראסטית (EDTA) עבור בקבוקונים T25. להסעיר את הבקבוק בעדינות, לדגור ב 37 °C (5 °F) במשך 2-5 דקות, ולאחר מכן להעריך את ההתקדמות אנזימטית תחת מיקרוסקופ אור. לאחר שהתאים מתחילים לעגל כלפי מעלה, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים מפני השטח.
    3. לאחר הניתוק, להשבית את פתרון הטריפסין על ידי הוספת פתרון טריפסין / תא לצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיה עבור צלוחיות T25. צנטריפוגה השעיית התא ב 120 x g במשך 2 דקות כדי לקבל גלולה תא רך. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 5 מ"ל של מדיה.
    4. כדי לבצע ספירת תאים ולאשר את הכדאיות של התא, לערבב aliquot של 10 μL של תאים resuspended ו 10 μL של צבע כחול טריפאן. ספור את התאים החיים באמצעות מונה תאים. לדלל את התאים עם מדיה רגילה טרייה כדי להשיג את צפיפות הזריעה הרצויה. כרכים מחושבים בהתאם לצפיפות הזרעים הרצויה וריכוז התאים של פתרונות מלאי. כל הציפוי צריך להתבצע בתנאים סטריליים.
    5. CMs צלחת בצפיפות זריעה של 300,000 לבאר על החלק התחתון של צלחת 24 באר מצופה מראש עם מטריצה חוץ תאית. לשמור על התאים ב 37 °C (55 °F) עם 21% O2 ו 5% CO2 לילה.
    6. לאחר 24 שעות, לוח ECs לתוך תוספות בצפיפות ציפוי אופטימלית של 100,000 לכל הוספה (שטח התרבות הוא 33.6 מ"מ2), (איור 1). לאחר 24 שעות של ציפוי EC, למקם EC מוסיף בתוך בארות CM, ייזום תרבות משותפת. אפשר לתאים לתרבות משותפת למשך 12-24 שעות לפני ביצוע הניסויים.
    7. ודא כי עד לביצוע הניסויים, הן ספקי שירותי אינטרנט והן מחשבים אלקטרוניים הגיעו למפגש של 80%-90%.

2. היפוקסיה/reoxygenation כדי לדמות איסכמיה / פגיעה reperfusion במבחנה

הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע כמתואר, לא להשהות בין לבין.

  1. הכן את המדיה היפוקסית על ידי שפיכת ~ 25 מ"ל של מדיה בצינור חרוטי 50 מ"ל. יש לאטום את החלק העליון עם קרום סיליקון ולהשתמש בפיפטה מעוקרת כדי לנקב חור. צור חור נוסף, הפעם משאיר את פיפטה שקועה כ 2/3 לתוך התקשורת.
  2. לשטוף את המדיה עם גז היפוקסי (0.0125% O2, 5% CO2, 94.99% N2) במשך 5 דקות בקצב זרימה של 30 ליטר / דקה. פעולה זו ממזערת O2 מומס במדיה כאשר היפוקסיה מתחילה (שלב 2.5).
  3. השלך את המדיה של 24-well-wells או תוספות תרבות המכילות תאים מצורפים ולשטוף עם 100 μL / היטב של 10% תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) בעדינות רבה. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של מדיה היפוקסית טרי מוכן לכל באר של הצלחות או מוסיף.
    הערה: היפוקסיה במדיה מופרעת בקצרה ככל האפשר במהלך שלב זה לפני היפוקסיה אמיתית עבור תאים ומדיה מתחילה בשלב 2.5.
    1. בקבוצת הביקורת הנורמוקסית, החלף את המדיה המקורית במדיה רגילה ורעננה המכילה גלוקוז וסרום.
  4. לחות את תא היפוקסיה על ידי הצבת צלחת פטרי מלא מים סטריליים בתוך החדר. לאחר מכן, מניחים את הצלחות המרכיבות את הקבוצות ההיפוקסיות לתוך התא.
  5. לשטוף את תא היפוקסיה עם גז היפוקסי (0.0125% O2, 5% CO2, 94.99% N2) במשך 5 דקות בזרימה של 30 ליטר / דקה. מניחים את התא באינקובטור 37 °C (37 °F) במשך 24 שעות.
  6. לאחר היפוקסיה, לטפח CMs ו- ECs בתנאים רגילים. לשם כך, השליכו את המדיה הישנה של הלוחות/תוספות, החליפו אותה במדיה רגילה (המכילה גלוקוז וסרום; 500 μL של כל באר/הוספה) ואחסנו אותה באינקובטור בתנאי תרבות רגילים (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C (37 °C) למשך 2 שעות כדי לחקות רפורמציה.
  7. כדי לשלוט בהשפעות כלשהן של החלפת מדיה, שנה את המדיה של תאים נורמוקסיים בו-זמנית עם שינוי המדיה ההיפוקסית.
    הערה: איור 2 מספק סקירה סכמטית של פרוטוקול זה.

3. הערכת נקודות קצה

  1. העבר את מדיית תרבית התאים מלוחית 24 הבאר לצלחת של 96 בארות. השתמש 200 μL של מדיה מכל באר של צלחת 24-well ולהפיץ באותה מידה לארבע בארות של צלחת 96-well, בהתאם. השתמש צלחת אחת כל אחד לנורמוקסיה לעומת היפוקסיה לעומת משאבי אנוש.
  2. לקבוע את מידת הפגיעה התאית, למשל, על ידי מדידת ספיגה עבור LDH באמצעות ערכת בדיקת ציטוטוקסיות בהתאם להוראות היצרן. בצע את הבדיקה בלוחית 96-well כפי שהונחה בפרוטוקול הבדיקה.

4. סטטיסטיקה

  1. הצג את הנתונים הפרמטריים כסטיית תקן/ממוצעת ונתונים שאינם פרמטריים כהתווי תיבות עם טווח חציון/בין-שוויוני. בדיקות השוואות פרמטריות נאותות לעומת בדיקות השוואות מרובות שאינן פרמטריות עם בדיקות פוסט-הוק מקובלות כדי להקטין את הסיכוי לשגיאה מסוג 1 יש לבצע. המשמעות מוגדרת בדרך כלל באלפא של 0.05 (דו-זנבי).
  2. עבור כל הניסויים שבוצעו במחקר הנוכחי, לבצע לפחות שלושה משתכפל היטב בתוך ניסוי אחד. היו שלוש עד שש חזרות על כל ניסוי ששימשו לניתוח סטטיסטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל שלושת סוגי התוספות (A, B, C) המשמשים בניסוי זה הם בעלי גודל נקבוביות זהה של 0.4 מיקרומטר. ההבדל היחיד ביניהם הוא גובה ההוספה לבסיס, המאפשר למרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה, (איור 3) ושהם מספקים שונים (לפרטים ראו טבלת חומרים).

כדי ליצור מודל של תרבות משותפת במבחנה עם שכבות נפרדות של שני קווי תאים העוברים משאבי אנוש כדי לדמות פגיעה ב- IR, בדקנו את שלמות קרום התא של CMs בתרבית משותפת עם או בלי ECs. שימוש בתוספת נפרדת עבור ECs שניתן למקם במרחקים שונים מעל שכבת CM אפשר לנו גם להעריך את ההשפעות הדיפרנציאליות של מרחק שכבת התא על חומרת הנזק לממברנה ב- CMs. בסדרה נפרדת של ניסויים, שינינו את הצפיפות של עולמות אלקטרוניים ולכן את היחס בין עולמות אלקטרוניים ל- CMs. בנוסף, כדי להבדיל בין איסכמיה מדומה לבין פגיעת אינפרא-אדום מדומה, בוצעו ניסויים בתנאים של 1) נורמוקסיה, 2) היפוקסיה בלבד ו-3) משאבי אנוש. עבור מודל זה, השתמשנו היפוקסיה 24 h, ואחריו 2 h reoxygenation.

מרחקים משתנים
מרחק של 0.5 מ"מ בין שכבות התא (הוספה A)
כאשר CMs היו מתורבתים לבד, היפוקסיה הובילה לשחרור LDH מוגבר באופן משמעותי בהשוואה לנורמוקסיה, בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו (איור 4A)6. עם זאת, LDH היה רק במתינות עוד יותר גדל על 2h reoxygenation לעומת הקבוצה היפוקסיה בלבד. כאשר ECs ו- CMs היו שותפים יחד לתרבות במרחק של 0.5 מ"מ, העלייה בשחרור LDH על ידי היפוקסיה בלבד לא נחלשה מה שמצביע על כך שה- ECs לא הראו שום אפקט מגן (בהשוואה לקבוצת CMs בלבד בתנאי היפוקסיה בלבד). עם זאת, ECs הפעילו הגנה קלה אך משמעותית על CMs במהלך משאבי אנוש.

מרחק של 1.0 מ"מ בין שכבות התא (הוספה B)
אותו ניסוי בוצע כאמור לעיל, אלא שהמרחק בין שתי שכבות התא הוגדל ל-1.0 מ"מ (איור 4B). מצאנו כי שחרור LDH היה גם גדל באופן משמעותי CMs-רק על ידי היפוקסיה בלבד. עם זאת, שלא כמו בהכנסת 0.5 מ"מ, העלייה LDH CMs-בלבד היה potentiated על ידי משאבי אנוש על היפוקסיה בלבד. יתר על כן, potentiation זה היה מעוכב יותר וכמעט בוטל על ידי נוכחות של ECs במהלך reoxygenation לעומת הקבוצה CMs בלבד.

מרחק של 2.0 מ"מ בין שכבות התא (הוספה C)
כאשר נעשה שימוש בתוספות של תרבות משותפת היוצרות מרחק של 2.0 מ"מ בין שני קווי התא (איור 4C), מצאנו גם עלייה משמעותית בשחרור LDH על ידי CMs בלבד במהלך היפוקסיה, באותה מידה כמו בניסויים של 0.5 מ"מ ו-1.0 מ"מ. מעניין, עם זאת, העלייה הנוספת בשחרור LDH על ידי reoxygenation היה בולט עוד יותר מאשר בניסויים 1.0 מ"מ. שתי העליות הללו היו מוחלשות, אם כי לא בוטלו, על ידי נוכחות של ECs, המציין כי שונה באמצעות תוספות 0.5 או 1.0 מ"מ, ECs מוגן באופן משמעותי CMs מפני פגיעה הן היפוקסיה בלבד והן תנאי משאבי אנוש.

עוצמות EC משתנות
בסדרה שונה של ניסויים, הריכוז של ECs מצופה תוספות 2.0 מ"מ היה titrated ל 25,000, 50,000 ו 100,000 תאים לכל הוספה, בהתאמה. שחרור LDH נמדד לאחר היפוקסיה של 24 שעות ואחריו 2 h reoxygenation. התוצאות שלנו הראו כי הגברת עוצמת EC בתרבות המשותפת הובילה להחלשה תלוית מינון של שחרור LDH הנגרמת על ידי משאבי אנוש (איור 5); שום השפעה כזו לא נראתה בתנאים נורמוקסליים.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הוספה בתוך הבאר. התוספות עם ה- ECs (עד 100,000 תאים לכל הוספה) מועברות ללוחות של 24 בארות עם ה- CMs (300,000 לבאר) בתחתיתן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עיצוב ניסיוני. תאים מתורבתים בתנאי חמצן רגילים (21% O2), ולאחר מכן מפוצלים לשתי קבוצות: קבוצת בקרה נורמוקסית תמשיך להיות מתורבתת בתנאים רגילים במשך 24 שעות נוספות, ואילו קבוצת היפוקסיה תהיה מתורבתת בתא היפוקסיה במשך 24 שעות עם רק 0.01% O2 וללא גלוקוז. לאחר התערבויות אלה של 24 שעות, שתי קבוצות התאים מתרעננות עם מדיה ומתרבות ללא הרף בסביבת O21% 2 למשך 2 שעות נוספות, שלב reoxygenation, לפני שבסופו של דבר מבצעות את בדיקת נקודות הקצה, למשל, ניתוח LDH. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות ושרטוטים של שלוש התוספות השונות. המרחק בין תאי האנדותל בהוספה לבין הקרדיומיוציטים בתחתית הבאר יכול להיות מגוון באמצעות תוספות שונות. כל שלושת סוגי התוספות המשמשות כאן הם בעלי גודל נקבוביות זהה של 0.4 מיקרומטר. ההבדל היחיד ביניהם הוא גובה ההוספה לבסיס, המאפשר את המרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5 (A), 1.0 (B) ו 2.0 מ"מ (C), בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואה בין שלושה סוגים של תוספות תרבית בהערכת שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH; ביחידות ספיגה [au]) תחת נורמוקסיקה (משמאל), היפוקסיה בלבד (במרכז) ותנאי היפוקסיה/ראוקסיגניה (מימין) עבור קרדיומיוציטים בלבד (CM; לבן), תאי אנדותל בלבד (EC; שחור) ותרביות משותפות של CM עם EC (תבנית בדיקה). (A) מרחק של 0.5 מ"מ, (B) מרחק של 1.0 מ"מ, מרחק של 1.0 מ"מ, מרחק, (B) מרחק של 1.0 מ"מ, מרחק, (B) מרחק של 1.0 מ"מ, מרחק, (C) מרחק של 2.0 מ"מ בין שתי שכבות התא השונות. ECs היו מצופים בצפיפות של 100,000 תאים לכל הוספה, CMs בצפיפות של 300,000 תאים לבאר. הנתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן, n = 4 לכל קבוצה. סטטיסטיקה: ANOVA ואחריו סטודנט-ניומן-Keuls מבחן פוסט הוק. P < 0.05 (דו-זנבי) המצוין על-ידי פסים אופקיים בין כל זוג בהשוואה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ריכוז תאי אנדותל בעלי תרבות משותפת (EC; 25: 25:25,000 תאים לכל הוספה; 50: 50,000 תאים לתוספת; 100: 100,000 תאים לכל הוספה) הגנה על קרדיומיוציטים (CM) מפני פגיעה בהיפוקסיה/ראוקסיגניה (מימין) בהשוואה לתנאים נורמוקסיים (משמאל) כפי שמעיד שחרורו של דהידרוגנאז לקטט (LDH; ביחידות ספיגה [au]. ECs לא הייתה השפעה על שחרור LDH בתנאים נורמוקסליים. הנתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן, n = 4 לכל קבוצה. סטטיסטיקה: ANOVA ואחריו סטודנט-ניומן-Keuls מבחן פוסט הוק. P < 0.05 (דו-זנבי) המצוין על-ידי פסים אופקיים בין כל זוג בהשוואה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו לחקר מנגנונים תאיים של cardioprotection. כיצד ליצור שתי שכבות נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן הוא, אם כן, חיוני לפיתוח מודל תרבות משותפת מתאים. אתגר בחקר IR מדומה, כלומר, משאבי אנוש, פגיעה הוא כי לא רק איסכמיה (היפוקסיה) עצמה, אלא גם רפרפוזיה (reoxygenation) מחמיר תפקוד תאי. לכן, מודל מציאותי צריך לשקף מאפיינים אלה על ידי, למשל, הפגנת פגיעה מוגברת מספיק על ידי reoxygenation בעקבות היפוקסיה לעומת היפוקסיה לבד, אבל עדיין מאפשר הנחתה של פגיעה עם תרופות מגן תא או אסטרטגיות כגון, במקרה שלנו, נוכחות של ECs. מעניין, המרחק בין שתי שכבות התא נראה לשחק תפקיד חשוב בפיתוח מודל תרבות משותפת מתאים. הצלחנו להוכיח כי מרחק של 1.0 מ"מ ומרחק של 2.0 מ"מ בין ECs ו- CMs אפשרו את התגובה הצפויה לפגיעה במשאבי אנוש, אך חשוב מכך, רק 2.0 מ"מ הניבו תוצאה חיובית באופן עקבי להגנה מפני פגיעה תאית על ידי נוכחות של ECs בתנאי היפוקסי ומשאבי אנוש.

שינויים ופתרון בעיות של השיטה
אינטראקציות בין תאים במודלים של תרבות משותפת מושפעות ממשתנים מרובים כגון מספר אוכלוסיות שונות בעלות תרבות משותפת, מידת הדמיון של סוגי התאים, מידת ההפרדה הפיזית ביניהם, ההבדל בין סביבות מקומיות באוכלוסייה, נפח התרבויות ושיקול התזמון של התרבות המשותפת 9,10,11,12 . קיימים חילופים בין גורמים אלה. אינטראקציות אלה מושפעות מאוד על ידי הסביבה, אשר בתורו נקבע על ידי הפרוטוקול וההגדרה. חשוב לפתח מודלים ניסיוניים הניתנים לשכפול, מדידים ודומים. הגישה שלנו הייתה לשלוט ולהגביל את מספר המשתנים שעלולים לשבש את עקביות הנתונים המתקבלים מניסויים שונים שנערכו בזמנים שונים באמצעות ציפוי מספר מדויק של תאים, תוך שימוש באותו יחס של שני קווי תאים בתרבית משותפת, אותם כרכים של מדיה תרבית התאים ו reagents הבדיקה, וכו ', למעט שלוש מוסיף תרבית התאים השונים.

מגבלות השיטה
המודל שלנו עובד היטב עם ECs ו- CMs, ככל הנראה חייב לנוכחות בכל מקום של ECs במערכת הלב וכלי הדם. עד כמה סוגים אחרים של שורות תאים בעלי עניין פוטנציאלי מתקשרים עם ספקי שירותי אינטרנט, נוירונים או תאים מעניינים אחרים שיש לחקור במבחנה עדיין לא מוערכים מכיוון שקווי תאים שונים יכולים לקיים אינטראקציה שונה בסביבת התרבות המשותפת. הבדל אחד בין אוכלוסיות התאים בתרבית משותפת יכול להיות מערכת היחסים האקולוגית שלהם, למשל, אם הם מתחרים טבעיים או משתפי פעולה. כמו כן, כמו בכל מודלים אחרים של תאי הפריה חוץ גופית , הנזק התאי שנוצר בניסוי לא יכול לייצג את המצב הפתופיזיולוגי בפועל של פגיעה ב- vivo. יתר על כן, אנו מכירים בכך שהמרחקים שנבדקו בין ECs ו- CMs של 0.5, 1.0 ו- 2.0 מ"מ אינם משחזרים את המרווח שלהם ב- vivo; עבור מודל הפריה חוץ גופית נתון; עם זאת, התוצאות שלנו מתארות את ההשלכות של התרחקות אופטימלית בין שתי שכבות תאים שייחקרו על ידי מדענים המעוניינים לנצל טכניקה זו.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
שיטות התרבות המשותפת הקיימות/חלופיות כוללות ערבוב ישיר של קווי תאים או יצירת סביבה מופרדת עם מידה של הפרדה כגון שימוש בלוחות טרנסוול13, פלטפורמות מיקרופלואידיות14 או פיגומים תלת מימדיים15, ביניהם לוחות transwell הם הזולים והקלים ביותר הזמינים. למרות מגבלות טבעיות, תרבויות משותפות רלוונטיות מאוד למחקר סמים מכיוון שהן מספקות נציגות רבה יותר במודל הרקמה דמוי vivo ומאפשרות בדיקות תפוקה גבוהה וניטור מעמיק של השפעות סמים על אינטראקציות בין תאיםסלולריים 16. המודל שלנו כויל במדויק באמצעות מרחקים מרחביים מוגדרים היטב בין ECs ו- CMs, במקום תערובת מלאה ובלתי מבוקרת של שני סוגים שונים של תאים. יתר על כן, מודל זה מאפשר טיפולים נפרדים ומנתח סוגים בודדים של תאים, אשר בלתי אפשרי להשיג בתרבות משותפת מעורבת, שלא לדבר על vivo. מכיוון שפגיעה ב-IR כרוכה בתהליכי משאבי אנוש נפרדים, מודל זה מתאים היטב לחקר המנגנונים התאיים של איסכמיה/היפוקסיה לעומת נזקי רפרטפוזיה/ראוקסיגניה בנפרד. הנתונים שלנו מצביעים על כך שזה עשוי להיות מודל תרבות שיתוף תאים בעל ערך רב ויעיל לשימוש במחקרי פגיעה אינפרא-אדום מדומים. התצפיות שלנו מצביעות בבירור על כך שמרחק מרחבי אופטימלי, במקרה שלנו 2.0 מ"מ, נחוץ למחשבים אלקטרוניים כדי להצליב עם CMs במודל תרבות משותפת ספציפי זה, כך שמולקולות איתות המופרשות באופן פוטנציאלי על ידי ה- ECs יכולות להסתובב ביעילות להגנה לא חוקית של CMs מפני פגיעה על ידי היפוקסיה בלבד ו / או משאבי אנוש.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטות בתחומי מחקר ספציפיים
המודל שלנו מציין את המשמעות של שילוב של ECs עורק כלילי עכבר עם CMs עכבר כדי לשפר את החקירה של אמצעי הגנה מפני פגיעה במשאבי אנוש; כי שינוי המרחק המרחבי של תרבויות משותפות מדגים דרך יעילה להבין טוב יותר את התנאים המרחביים המשפיעים על פעולת ההגנה של ECs על פגיעת CM הנגרמת על ידי משאבי אנוש; וכי הצפיפות של ECs או יחס EC-ל- CM הוא בקורלציה חיובית למידת ההגנה מפני פגיעה במשאבי אנוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה, בין היתר, על ידי המחלקה האמריקאית לענייני יוצאי צבא שירות מו"פ מעבדה ביו-רפואית (I01 BX003482) ועל ידי קרנות מוסדיות ל- M.L.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) Celprogen Inc 11041-14 Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II Invitrogen A27977 Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet Nuaire NU425400 Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium Cell Biologics Inc 6916 Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator Nuaire Nu-5500 To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank A-L Compressed Gases UN1013 Gas needed for cell culture incubator 
Cell Culture Inserts A (0.5 mm) Corning Inc 353095 Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm) Millicell Millipore PIHP01250 Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm) Greiner Bio-One 662640 Used for EC-CM co-culture
Centrifuge Anstel Enterprises Inc 4235 For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25 Celprogen Inc E11041-14 Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete Celprogen Inc M11041-14S CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free Celprogen Inc M11041-14PN CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well Celprogen Inc E11041-14-96well Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium Celprogen Inc M11041-14GFPN CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283 Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit Thermo Scientific  C20301 LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25 Fisher Scientific  FB012935 Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete Cell Biologics Inc M1168 ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free Cell Biologics Inc M1168PF ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well Fisher Scientific (Costar) 3370 Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution Cell Biologics Inc 6950 Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium Cell Biologics Inc GPF1168 ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35011CV FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber StemCell Technologies 27310 To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter StemCell Technologies 27311 To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) A-L Compressed Gases UN1956 Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope  Nikon TMS To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) Cell Biologics Inc C57-6093 Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes Fisher Scientific 12565269 For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes Fisher Scientific 12565271 For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader BioTek Instrument 11120533 Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid) Fisher Scientific 12565226 Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs Celprogen Inc T1509-014 1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs Cell Biologics Inc 6914/0619 0.25%, cell cuture-tested

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
  3. Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
  4. Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
  5. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  6. Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).
  7. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
  8. Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
  9. vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
  10. Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
  11. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661 (2011).
  12. Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711 (2012).
  13. Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661 (2011).
  16. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 176
פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה <em>במבחנה במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Hampton, M. J. W., Barajas,… More

Li, Z., Hampton, M. J. W., Barajas, M. B., Riess, M. L. Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (176), e62913, doi:10.3791/62913 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter