Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro
Summary
La distancia espacial es un parámetro clave en la evaluación de la lesión por hipoxia/reoxigenación en un modelo de cocultivo de capas separadas de células endoteliales y cardiomiocitarias, lo que sugiere, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de los cardiomiocitos.
Abstract
La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo. La reperfusión causa lesiones adicionales más allá de la isquemia. Las células endoteliales (CE) pueden proteger a los cardiomiocitos (CM) de la lesión por reperfusión a través de las interacciones célula-célula. Los cocultivos pueden ayudar a investigar el papel de las interacciones célula-célula. Un cocultivo mixto es el enfoque más simple, pero es limitado ya que los tratamientos aislados y los análisis posteriores de tipos de células individuales no son factibles. Para investigar si las CE pueden atenuar el daño de las células CM dependiendo de la dosis y si esta protección puede optimizarse aún más variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares, utilizamos células endoteliales de la arteria coronaria primaria de ratón y cardiomiocitos de ratón adulto para probar tres tipos de insertos de cultivo celular que variaron en su distancia de capa intercelular a 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente. Solo en los CM, la lesión celular evaluada por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) aumentó significativamente durante la hipoxia y más adelante tras la reoxigenación cuando la distancia fue de 2,0 mm en comparación con 0,5 y 1,0 mm. Cuando los CE y los CM estaban en contacto casi directo (0,5 mm), solo hubo una atenuación leve de la lesión por reoxigenación de los CM después de la hipoxia. Esta atenuación aumentó significativamente cuando la distancia espacial fue de 1,0 mm. Con una distancia de 2,0 mm, las CE atenuaron la lesión de CM durante la hipoxia y la hipoxia / reoxigenación, lo que indica que es necesario un distanciamiento de cultivo suficiente para que las CE se diaguen con los CM, de modo que las moléculas de señal secretadas puedan circular y estimular completamente las vías protectoras. Nuestros hallazgos sugieren, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo CE/CM es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las CE en la protección contra la CM contra la lesión simulada de isquemia/reperfusión. El objetivo de este informe es proporcionar un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.
Introduction
La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo 1,2. Sin embargo, el proceso de tratamiento de la reperfusión puede causar la muerte de los cardiomiocitos, conocida como lesión por isquemia/reperfusión (IR) miocárdica, para la cual todavía no existe un remedio efectivo3. Se ha sugerido que las células endoteliales (CE) protegen los cardiomiocitos (CM) a través de la secreción de señales paracrinas, así como las interacciones de célula a célula4.
Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para investigar el papel de las interacciones célula-célula autocrina y /o paracrina en la función y diferenciación celular. Entre los modelos de cocultivo, el cocultivo mixto es el más simple, donde dos tipos diferentes de células están en contacto directo dentro de un solo compartimento de cultivo en una proporción celular deseada5. Sin embargo, los tratamientos separados entre tipos de células y el análisis posterior de un solo tipo de célula no son fácilmente factibles dada la población mixta.
Estudios previos indicaron que los insultos hipóxicos e isquémicos causan un daño significativo a la integridad de la membrana celular medido por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Esta lesión empeora con la reoxigenación, imitando la lesión por reperfusión 6,7,8. El objetivo del protocolo actual era probar las hipótesis de que la presencia de CE puede atenuar la pérdida de CM en la membrana celular causada por hipoxia y reoxigenación (HR) y que el efecto protector de las CE puede optimizarse variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares. Por lo tanto, empleamos tres tipos de insertos de cultivo celular y células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón y cardiomiocitos de ratón adulto. Los insertos, marcados por Corning, Merck Millipore y Greiner Bio-One, nos permitieron crear tres condiciones de diafonía de cultivo celular diferentes con distancias de línea intercelular de 0.5, 1.0 y 2.0 mm, respectivamente. Se enchaparon 100.000 CE por inserto en cada caso.
Además, para determinar si la densidad de LAS CE en el cocultivo contribuye a la atenuación de la lesión de la FC en este modelo, estudiamos la relación dosis-respuesta entre la concentración de CE y la liberación de LDH por los CM. Las CE se enchaparon en 25.000, 50.000 y 100.000 por inserto, respectivamente, en el inserto de 2,0 mm.
Este informe proporciona un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Se han utilizado modelos de cocultivo celular para estudiar los mecanismos celulares de cardioprotección. Cómo crear dos capas separadas con una distancia significativa entre ellas es, por lo tanto, crucial para el desarrollo de un modelo de co-cultura adecuado. Un desafío en el estudio de la lesión por IR simulada, es decir, la FC, es que no solo la isquemia (hipoxia) en sí, sino también la reperfusión (reoxigenación) agrava la disfunción celular. Por lo tanto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Servicio de I + D del Laboratorio Biomédico del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (I01 BX003482) y por fondos institucionales a M.L.R.
Materials
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
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