复发性流产中4种子宫内膜免疫细胞类型的多重荧光免疫组织化学染色
Summary
尽管多重免疫组织化学和多光谱成像取得了进展，但同时表征子宫内膜中主要免疫细胞的密度和聚集仍然是一个挑战。本文描述了一种详细的多重染色方案和成像，用于同时定位子宫内膜中四种免疫细胞类型。
Abstract
免疫组化是生物学研究和临床诊断中组织抗原鉴定和可视化的最常用方法。它可用于表征各种生物过程或病理学，例如伤口愈合，免疫反应，组织排斥和组织 – 生物材料相互作用。然而，使用常规免疫组织化学（IHC）染色在单个组织切片中对多种抗原（特别是对于免疫细胞）的可视化和定量仍然不令人满意。因此，近年来引入了多重技术来鉴定单个组织样品或不同组织样品集合中的多种生物标志物。
这些技术在区分可育妇女和植入期间复发性流产妇女之间子宫内膜内免疫细胞间相互作用的变化方面特别有用。本文描述了多重荧光IHC染色的详细方案，以研究胚胎植入期间精确定时子宫内膜标本中四种主要免疫细胞类型的密度和聚类。该方法包括样品制备，使用免疫细胞亚型标记物进行多重优化，以及扫描载玻片，然后进行数据分析，并特别参考检测子宫内膜免疫细胞。
使用这种方法，可以在单个组织切片中同时分析子宫内膜中四种主要免疫细胞类型的密度和聚类。此外，本文还将讨论关键因素和故障排除，以克服所应用的荧光探针之间可能存在的荧光团干扰。重要的是，这种多重染色技术的结果可以帮助深入了解胚胎植入过程中的免疫相互作用和调节。
Introduction
复发性流产（RM）可定义为妊娠24周前两次或两次以上妊娠的损失1。这种频繁的生殖状况影响了全球高达1%的夫妇2，3。病理生理学是多因素的，可分为胚胎学驱动的原因（主要是由于胚胎核型异常）和影响子宫内膜和/或胎盘发育的母体驱动的原因。这种表现可由父母遗传异常，子宫异常，血栓前疾病，内分泌因素和免疫性疾病引起4。
近年来，免疫效应细胞功能障碍与早孕丢失的发病机制有关5。这激发了许多研究，以阐明月经周期，植入和早孕期间子宫内膜中免疫细胞的特定群体，并在妊娠早期具有特定作用。在这些免疫细胞中，子宫自然杀伤（uNK）细胞在胚胎植入和怀孕期间起着关键作用，特别是在滋养细胞侵袭和血管生成过程中6。研究表明，RM7，8的女性子宫内膜的uNK细胞密度增加，尽管这一发现与流产风险增加无关9。然而，这刺激了研究评估其他免疫细胞类型（如巨噬细胞，子宫树突状细胞）在RM10，11的女性子宫内膜中的密度。然而，仍然不确定RM女性植入围膜内膜的免疫细胞密度是否有显着改变。
对不确定性的一种可能的解释是，由于植入窗口期间子宫内膜的快速变化，评估子宫内膜免疫细胞密度可能很困难。在24小时的时间范围内，子宫内膜的显着变化改变了免疫细胞密度和细胞因子分泌，在这些结果中引入了变异源12。此外，大多数报告主要依赖于使用单细胞染色（例如，传统的IHC方法），无法检查同一组织切片上的多个标记。虽然流式细胞术可用于检测单个样品中的多个细胞群，但所需的大量细胞和耗时的优化阻碍了该方法的普及和效率。因此，多重IHC染色的最新进展可以通过在同一张载玻片上免疫染色多个标记物来评估多个参数，包括细胞谱系和单个免疫亚群的组织学定位，从而解决这个问题。此外，该技术可以在组织可用性有限的情况下最大化所获得的信息。最终，这项技术可以帮助阐明肥沃女性和RM女性之间子宫内膜免疫细胞相互作用的差异。
从威尔士亲王医院招募了两组妇女，包括生育控制妇女（FC）和不明原因复发性流产妇女（RM）。受精控制被定义为至少有一次活产而没有任何自发性流产史的女性，RM女性被定义为在妊娠20周前有≥2次连续流产史的女性。两组受试者符合以下纳入标准：（a）年龄在20至42岁之间，（b）非吸烟者，（c）月经周期正常（25-35天）和正常的子宫结构，（d）子宫内膜活检前至少3个月不使用任何激素方案，（e）通过子宫内膜输卵管造影没有输卵管积水。此外，所有招募的受试者核型正常，三维超声宫腔造影正常，第2天卵泡刺激素30 nmol /L，甲状腺功能正常，狼疮抗凝剂和抗心磷脂IgG和IgM抗体检测呈阴性。
为了更好地了解RM的免疫学基础，最理想的方法是同时定量和定位植入时子宫内膜中存在的主要免疫细胞类型。本文描述了从样品制备，免疫细胞亚型标记物的多重优化以及载玻片扫描的整个方案，然后进行数据分析，并特别参考检测子宫内膜免疫细胞。此外，本文还描述了如何同时确定子宫内膜中免疫细胞类型的密度和聚类。
Protocol
Representative Results
Discussion
协议中的关键步骤
重要的是要注意，多重染色需要勤奋的优化。使用柠檬酸盐缓冲液和微波技术的抗原检索需要优化，以确保完全剥离抗体并保持组织活力。由于TSA试剂共价结合到抗原周围的位点，它们可以通过空间位阻（也称为”伞效应”）潜在地抑制后续一抗的结合。当多个免疫标志物驻留在单个细胞室中并引起荧光团干扰时，往往会发生这种情况。为了确定是否会有效果，事?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究于2018年获香港妇产科信托基金及香港健康及医学研究基金（06170186，07180226）资助。
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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