Gemultiplexte fluoreszierende immunhistochemische Färbung von vier endometrialen Immunzelltypen bei wiederkehrenden Fehlgeburten
Summary
Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.
Abstract
Die Immunhistochemie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik. Es kann verwendet werden, um verschiedene biologische Prozesse oder Pathologien wie Wundheilung, Immunantwort, Gewebeabstoßung und Gewebe-Biomaterial-Interaktionen zu charakterisieren. Die Visualisierung und Quantifizierung mehrerer Antigene (insbesondere für Immunzellen) in einem einzigen Gewebeschnitt mittels konventioneller immunhistochemischer (IHC) Färbung bleibt jedoch unbefriedigend. Daher wurden in den letzten Jahren multiplexe Technologien eingeführt, um mehrere biologische Marker in einer einzelnen Gewebeprobe oder einem Ensemble verschiedener Gewebeproben zu identifizieren.
Diese Technologien können besonders nützlich sein, um die Veränderungen der Immun-Zell-zu-Zell-Interaktionen innerhalb des Endometriums zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit wiederkehrenden Fehlgeburten während der Implantation zu differenzieren. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die multiplexierte Fluoreszenz-IHC-Färbung, um die Dichte und Clusterbildung von vier wichtigen Immunzelltypen gleichzeitig in genau getimten Endometriumproben während der Embryonenimplantation zu untersuchen. Die Methode umfasst die Probenvorbereitung, die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen und das Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug auf den Nachweis endometrialer Immunzellen.
Mit dieser Methode kann die Dichte und Clusterbildung von vier großen Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die kritischen Faktoren und die Fehlerbehebung diskutiert, um mögliche Fluorophor-Interferenzen zwischen den aufgetragenen Fluoreszenzsonden zu überwinden. Wichtig ist, dass die Ergebnisse dieser Multiplex-Färbetechnik dazu beitragen können, ein tiefes Verständnis der immunologischen Interaktion und Regulation während der Embryonenimplantation zu vermitteln.
Introduction
Wiederkehrende Fehlgeburten (RM) können als der Verlust von zwei oder mehr Schwangerschaften vor der 24. Schwangerschaftswoche definiert werden1. Diese häufige Fortpflanzungsstörung betrifft bis zu 1% der Paare weltweit2,3. Die Pathophysiologie ist multifaktoriell und kann in embryologisch getriebene Ursachen (hauptsächlich aufgrund eines abnormalen embryonalen Karyotyps) und mütterlich getriebene Ursachen unterteilt werden, die die Endometrium- und / oder Plazentaentwicklung beeinflussen. Diese Manifestation kann aus elterlichen genetischen Anomalien, Uterusanomalien, prothrombotischen Zuständen, endokrinologischen Faktoren und immunologischen Störungenresultieren 4.
In den letzten Jahren wurde die Dysfunktion der Immuneffektorzellen mit der Pathogenese des frühen Schwangerschaftsverlustes in Verbindung gebracht5. Dies hat viele Untersuchungen zur Aufklärung der spezifischen Populationen von Immunzellen im Endometrium während des Menstruationszyklus, der Implantation und der frühen Schwangerschaft mit spezifischen Rollen in der frühen Schwangerschaft inspiriert. Unter diesen Immunzellen spielen Uteruszellen des natürlichen Killers (uNK) eine entscheidende Rolle während der Embryonenimplantation und Schwangerschaft, insbesondere bei den Prozessen der trophoblastischen Invasion und Angiogenese6. Studien haben eine erhöhte uNK-Zelldichte im Endometrium von Frauen mit RM7, 8gezeigt,obwohl dieser Befund nicht miteinemerhöhten Risiko für eine Fehlgeburt verbunden war9. Dies stimulierte jedoch die Forschung zur Bewertung der Dichte anderer Immunzelltypen (wie Makrophagen, dendritische Uteruszellen) im Endometrium bei Frauen mit RM10,11. Dennoch bleibt ungewiss, ob es bei Frauen mit RM zu einer signifikanten Veränderung der Immunzelldichte im Periimplantations-Endometrium kommt.
Eine mögliche Erklärung für die Unsicherheit ist, dass die Bewertung der endometrialen Immunzelldichte aufgrund der schnellen Veränderungen des Endometriums während des Implantationsfensters schwierig sein könnte. Während des 24-Stunden-Zeitrahmens verändern signifikante Veränderungen im Endometrium die Immunzelldichte und die Zytokinsekretion, was zu einer Variationsquelle in diesen Ergebnissenführt 12. Darüber hinaus stützen sich die meisten Berichte hauptsächlich auf die Verwendung von Einzelzellfärbungen (z. B. traditionelle IHC-Methoden), die nicht mehrere Marker auf demselben Gewebeschnitt untersuchen konnten. Obwohl die Durchflusszytometrie zum Nachweis mehrerer Zellpopulationen in einer einzigen Probe verwendet werden kann, behindern die großen Mengen an benötigten Zellen und die zeitaufwändige Optimierung die Popularität und Effizienz dieser Methode. Daher könnte die jüngste Weiterentwicklung der Multiplex-IHC-Färbung dieses Problem lösen, indem mehrere Marker auf demselben Objektträger immungefärbt werden, um mehrere Parameter zu bewerten, einschließlich der Zelllinie und der histologischen Lokalisation einzelner Immunsubpopulationen. Darüber hinaus kann diese Technologie die erhaltenen Informationen im Falle einer begrenzten Gewebeverfügbarkeit maximieren. Letztendlich kann diese Technik helfen, die Unterschiede in den Immunzellinteraktionen im Endometrium zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit RM aufzuklären.
Zwei Gruppen von Frauen wurden aus dem Prince of Wales Hospital rekrutiert, darunter fruchtbare Kontrollfrauen (FC) und Frauen mit unerklärlichen wiederkehrenden Fehlgeburten (RM). Fruchtbare Kontrolle war definiert als Frauen, die mindestens eine Lebendgeburt ohne spontane Fehlgeburt in der Vorgeschichte hatten, und RM-Frauen wurden als diejenigen definiert, die vor der 20. Schwangerschaftswoche eine Vorgeschichte von ≥2 aufeinanderfolgenden Fehlgeburten hatten. Die Probanden aus den beiden Gruppen erfüllten die folgenden Einschlusskriterien: (a) Alter zwischen 20 und 42 Jahren, (b) Nichtraucher, (c) regelmäßiger Menstruationszyklus (25-35 Tage) und normale Gebärmutterstruktur, (d) keine Anwendung eines hormonellen Regimes für mindestens 3 Monate vor der Endometriumbiopsie, (e) keine Hydrosalpinx durch Hystero-Salpingogramm. Darüber hinaus hatten alle rekrutierten Probanden eine normale Karyotypisierung, ein normales 3-dimensionales Ultraschall-Hysterosalpingogramm, ein follikelstimulierendes Hormon am Tag 2 30 nmol / L, eine normale Schilddrüsenfunktion und wurde negativ auf Lupus-Antikoagulans und Anticardiolipin-IgG- und IgM-Antikörper getestet.
Um die immunologischen Grundlagen der RM besser zu verstehen, wäre es am wünschenswertesten, die wichtigsten Immunzelltypen, die zum Zeitpunkt der Implantation im Endometrium vorhanden sind, gleichzeitig zu quantifizieren und zu lokalisieren. Dieser Beitrag beschreibt das gesamte Protokoll von der Probenvorbereitung über die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen bis hin zum Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug zum Nachweis endometrieller Immunzellen. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit, wie die Dichte und Clusterbildung der Immunzelltypen gleichzeitig im Endometrium bestimmt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es ist wichtig zu beachten, dass die Multiplexfärbung eine sorgfältige Optimierung erfordert. Die Antigengewinnung unter Verwendung der Citratpuffer- und Mikrowellentechnologie erfordert eine Optimierung, um ein vollständiges Antikörper-Stripping sicherzustellen und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Da TSA-Reagenzien kovalent an Stellen binden, die das Antigen umgeben, können sie möglicherweise die Bindung eines nachfolgenden primären Anti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde 2018 vom Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund und dem Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226) unterstützt.
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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