Summary
Несмотря на достижения в мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации, характеристика плотности и кластеризации основных иммунных клеток одновременно в эндометрии остается проблемой. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексного окрашивания и визуализации для одновременной локализации четырех типов иммунных клеток в эндометрии.
Abstract
Иммуногистохимия является наиболее часто используемым методом идентификации и визуализации тканевых антигенов в биологических исследованиях и клинической диагностике. Он может быть использован для характеристики различных биологических процессов или патологий, таких как заживление ран, иммунный ответ, отторжение тканей и взаимодействие тканей с биоматериалом. Однако визуализация и количественная оценка нескольких антигенов (особенно для иммунных клеток) в одном участке ткани с использованием обычного иммуногистохимического (IHC) окрашивания остается неудовлетворительной. Следовательно, в последние годы были внедрены мультиплексированные технологии для идентификации нескольких биологических маркеров в одном образце ткани или ансамбле различных образцов тканей.
Эти технологии могут быть особенно полезны для дифференциации изменений в иммунных межклеточных взаимодействиях в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с рецидивирующими выкидышами во время имплантации. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексированного флуоресцентного окрашивания IHC для исследования плотности и кластеризации четырех основных типов иммунных клеток одновременно в точно синхронизированных образцах эндометрия во время имплантации эмбриона. Метод включает в себя пробоподготовку, мультиплексную оптимизацию маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирование слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия.
Используя этот метод, плотность и кластеризация четырех основных типов иммунных клеток в эндометрии могут быть одновременно проанализированы в одном участке ткани. Кроме того, в этом документе будут обсуждаться критические факторы и устранение неполадок для преодоления возможной флуорофорной интерференции между применяемыми флуоресцентными зондами. Важно отметить, что результаты этого метода мультиплексного окрашивания могут помочь обеспечить глубокое понимание иммунологического взаимодействия и регуляции во время имплантации эмбриона.
Introduction
Повторный выкидыш (РМ) может быть определен как потеря двух или более беременностей до 24 недель беременности1. Этим частым репродуктивным состоянием страдает до 1% пар во всем мире2,3. Патофизиология является многофакторной и может быть разделена на эмбриологически обусловленные причины (в основном из-за аномального эмбрионального кариотипа) и материнские причины, которые влияют на эндометрий и / или плацентарное развитие. Это проявление может быть результатом родительских генетических аномалий, аномалий матки, протромботических состояний, эндокринологических факторов и иммунологических нарушений4.
В последние годы дисфункция иммунных эффекторных клеток была вовлечена в патогенез ранней потери беременности5. Это вдохновило многие исследования по выяснению конкретных популяций иммунных клеток в эндометрии во время менструального цикла, имплантации и ранней беременности, с конкретными ролями на ранних сроках беременности. Среди этих иммунных клеток клетки-естественные киллеры матки (uNK) играют решающую роль во время имплантации эмбриона и беременности, особенно в процессах трофобластической инвазии и ангиогенеза6. Исследования показали повышенную плотность клеток uNK в эндометрии женщин с РМ7,8,хотя этот вывод не был связан с повышенным рискомвыкидыша 9. Тем не менее, это стимулировало исследования, оценивающие плотность других типов иммунных клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки матки) в эндометрии у женщин с RM10,11. Тем не менее, остается неясным, происходит ли значительное изменение плотности иммунных клеток в периимплантационном эндометрии у женщин с РМ.
Одним из возможных объяснений неопределенности является то, что оценка плотности иммунных клеток эндометрия может быть затруднена из-за быстрых изменений в эндометрии во время окна имплантации. В течение 24-часового периода значительные изменения в эндометрии изменяют плотность иммунных клеток и секрецию цитокинов, вводя источник вариаций в эти результаты12. Кроме того, большинство отчетов в основном основаны на использовании одноклеточного окрашивания (например, традиционных методов IHC), которые не могут исследовать несколько маркеров на одном и том же участке ткани. Хотя проточная цитометрия может быть использована для обнаружения нескольких клеточных популяций в одном образце, большое количество необходимых клеток и трудоемкая оптимизация препятствуют популярности и эффективности этого метода. Следовательно, недавний прогресс в мультиплексном окрашивании IHC может решить эту проблему путем иммуноокрашивания нескольких маркеров на одном слайде для оценки нескольких параметров, включая клеточную линию и гистологическую локализацию отдельных иммунных субпопуляций. Кроме того, эта технология может максимизировать информацию, полученную в случае ограниченной доступности тканей. В конечном счете, этот метод может помочь прояснить различия во взаимодействиях иммунных клеток в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с РМ.
Две группы женщин были набраны из больницы принца Уэльского, в том числе фертильные контрольные женщины (FC) и женщины с необъяснимым повторным выкидышем (RM). Фертильный контроль был определен как женщины, у которых был по крайней мере один живой род без какой-либо истории спонтанного выкидыша, а женщины РМ были определены как те, у кого была история ≥2 последовательных выкидышей до 20 недель беременности. Испытуемые из двух групп соответствовали следующим критериям включения: (a) возраст от 20 до 42 лет, (b) некурящий, (c) регулярный менструальный цикл (25-35 дней) и нормальная структура матки, (d) не использование какого-либо гормонального режима в течение как минимум 3 месяцев до биопсии эндометрия, (e) отсутствие гидросальпинкса с помощью гистеросальпингограммы. Кроме того, все набранные субъекты имели нормальное кариотипирование, нормальную 3-мерную ультрасонографическую гистеросальпингограмму, фолликулостимулирующий гормон 2-й день < 10 МЕ / л, среднелютеиновый прогестерон > 30 нмоль / л, нормальную функцию щитовидной железы и отрицательный результат на антикоагулянты волчанки и антикардиолипиновые антитела IgG и IgM.
Чтобы лучше понять иммунологическую основу РМ, было бы наиболее желательно одновременно количественно оценить и локализовать основные типы иммунных клеток, присутствующих в эндометрии во время имплантации. В этой статье описывается весь протокол от подготовки образцов, мультиплексной оптимизации с маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирования слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия. Кроме того, в данной работе описывается, как определить плотность и кластеризацию типов иммунных клеток одновременно в эндометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено Объединенным комитетом по этике клинических исследований Восточного кластера Китайского университета Гонконга и Новых территорий. Информированное согласие было получено от участниц перед сбором биопсии эндометрия. Критерии включения контрольной и РМ групп см. в разделе введения.
1. Пробоподготовка
- Убедитесь, что все женщины в этом исследовании проходят ежедневный анализ мочи с 9-го дня менструального цикла, чтобы идентифицировать всплеск лютеинизирующего гормона (ЛГ) для выявления овуляции, и вовремя биопсию эндометрия точно на7-й день после всплеска ЛГ (ЛГ + 7).
- Получите фрагмент биопсии эндометрия размером0,5 см2 с помощью пробоотборника Pipelle или Pipet Curet у фертильных женщин и женщин с необъяснимым РМ. Маркируйте контейнер и поместите образец сразу в 10% нейтрально-буферизованный формалин (рН 7) для ночной фиксации при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фиксатора должен быть в 5-10 раз больше, чем у ткани. - Поместите ткань в картридж для обезвоживания в машине для обработки тканей, прежде чем встраивать ее в расплавленный парафиновый воск. Встраивают ткани в парафин при 58-60 °C.
- Дайте парафиновому блоку остыть в течение ночи при комнатной температуре. Используйте микротом, чтобы обрезать парафиновые блоки до толщины 3 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование дистиллированной воды способствует правильному креплению тканей и сцеплению на протяжении всего мультиплексного окрашивания. - Поместите парафиновую ленту на водяную баню при 40-45 °C в течение 30 с.
- Установите секции на стеклянные стекла микроскопа с поли-L-лизином (0,1% мас./об.) с покрытием. Поместите горки тканью вверх и дайте высохнуть при 37 °C в течение ночи. Храните слайды в коробке для слайдов вдали от экстремальных температур до дальнейшего использования.
2. Определите идеальную концентрацию антител для мультиплексного IHC с помощью обычного IHC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для определения уровня экспрессии и структуры каждого иммунного маркера в образце эндометрия и определения последовательности окрашивания каждого маркера, а также связанных с ними пар флуорофоров с амплификацией тирамидного сигнала (TSA).
- Протестируйте антитела на их пригодность для мультиплексного IHC с помощью ручного обычного IHC13.
- Используйте ткани эндометрия для тестирования на одиночные антитела.
- Включают положительный контроль (например, селезенка) и отрицательный контроль (контроль изотипа) для оптимизации состояния окрашивания каждого антитела.
- Выполните окрашивание, используя разведение, рекомендованное в техническом описании антитела.
- Выполняют дополнительное окрашивание с использованием концентраций выше и ниже рекомендуемого разбавления, используемого на этапе 2.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клинический патологоанатом должен оценивать окрашенные слайды вслепую, чтобы подтвердить локализацию зондирования антител и клеточную целостность.
3. Метод мультиплексного окрашивания
- Подготовка и фиксация слайдов
- Выложите горки (из шага 1.6) плоской тканью вверх в духовку и выпекайте при 60 °C в течение не менее 1 ч.
- Извлеките горки из духовки и дайте им остыть не менее 20 минут при комнатной температуре, прежде чем поместить их в вертикальную скользящую стойку.
- Депаракс и регидратация закрепленных формалином, парафиновых слайдов с 10 мин, отведенных на каждый из следующих этапов: ксилол (2x), 100% этанол (2x), 95% этанол (1x), 70% этанол (2x) и дистиллированная вода (2x).
- Поместите стойку с горками в пластиковую коробку и погрузите их в физиологический раствор, буферизованный Tris (TBS, pH 7,6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Горки должны оставаться влажными, начиная с этого этапа регидратации до монтажа на заключительном этапе. - Зафиксируйте образцы, погрузив слайды в пластиковую коробку, заполненную смесью формальдегида, разведенного метанолом (1:9) на 30 мин в темноте.
- Дважды вымойте горки в деионизированной воде в течение 2 минут, а затем приступайте к извлечению антигена.
- Извлечение эпитопов
- Поместите стойку с горками в термостойкую коробку и заполните ее буфером лимонной кислоты (рН 6,0), чтобы покрыть слайды.
- Поместите коробку в микроволновую печь и нагревайте слайды в течение 50 с при 100% мощности, а затем 20 минут при 20% мощности для поддержания той же температуры.
- Дайте слайдам остыть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.
- Промойте горки в воде в течение 2 минут, а затем TBS-Tween 20 (TBST) в течение 2 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: TBST состоит из 25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20 (v/v).
- Блокировка
- Блокируют активность эндогенной пероксидазы в ткани, погружая слайд на банку, содержащую раствор, блокирующий пероксидазу (см. Таблицу материалов)на 10 мин.
- Мойте горки с помощью TBST в течение 5 минут.
- Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы отметить границу вокруг участка ткани на слайде.
- Накройте участки тканей блокирующим буфером (см. Таблицу материалов)или бычьим сывороточным альбумином (5%, мас./об.) и инкубируйте слайды в увлажненной камере в течение 15 мин.
- Применение антител и сигналов
- Удалите блокирующие реагенты.
- Инкубировать с первичным антителом, представляющим интерес (например, CD3, разведение 1:100 в разбавителе антител, см. Таблицу 1)в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалить первичное антитело. Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз.
- Инкубировать с полимерным пероксидазой (HRP)-меченым вторичным антителом(таблица 1)в течение 15 мин в увлажненной камере при комнатной температуре. Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз.
- Применяют рабочий раствор опалового флуорофора TSA (1:100 в амплификационном разбавителе) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы обеспечить конъюгацию флуорофора с образцом ткани в местах первичного связывания антител. Мойте с ПОМОЩЬЮ TBST в трех экземплярах в течение 5 мин каждый раз.
- Зачистка на основе микроволновой печи
- Промыть антигенным буфером (цитратный буферный раствор, рН 6,0).
- Выполните вскрышную обработку на основе микроволновой печи для удаления первично-вторичного комплекса HRP для введения следующего первичного антитела (например, CD20).
- Поместите слайды в буфер извлечения антигена, разогрейте их в микроволновой печи на 100% мощности в течение 50 с, а затем 20% мощности в течение 20 минут в контейнерах, безопасных для микроволновой печи, и охладите их при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Повторяйте шаги с 3.2.4 по 3.5.2 до тех пор, пока образцы тканей не будут исследованы всеми первичными антителами.
- Крепление и монтаж
- После очистки в микроволновой печи и охлаждения буфера извлечения антигена промойте слайды в дистиллированной воде и TBST.
- Инкубировать с 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) раствором (1,0 мкг/мл) в течение 5 мин в увлажненной камере при комнатной температуре.
- Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз. Промыть водой один раз в течение 5 мин.
- Высушите горку на воздухе и установите ее с помощью соответствующего монтажного носителя (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для моноплексных слайдов, используемых для разработки спектральной библиотеки, не требуется контрраскрашивание.
4. Изображение и анализ
- Подготовка слайдов спектральной библиотеки
- Создавайте библиотечные слайды (однопятнистые эталонные изображения) для каждого флуорофора, DAPI и автофлуоресценции с одной и той же управляющей тканью для мультиспектрального анализа изображений.
- Используя слайды образцов биопсии эндометрия от женщин с РМ и фертильных женщин, выполните шаги от 1,1 до 3,6,4 для обнаружения одного антитела для каждого слайда (без дальнейшего добавления антител или флуорофора).
- Для каждого обнаружения антител окрашивают один из слайдов DAPI (как на этапе 3.6.2) и оставляют один слайд незапятнанным для обнаружения любой возможной автофлуоресценции тканей в спектре.
- Используйте соответствующие фильтры на рабочей станции для получения изображения для этого набора слайдов для каждого антитела и загрузите их в библиотеку анализа изображений (как описано в шаге 4.2).
- После захвата изображения выберите inForm в качестве источника спектральной библиотеки и создайте спектральную библиотеку.
- Поскольку флуорофоры используются, выберите в меню пункт Пятна/Флуоры...
- При выборе пятен или флуорофоров сузьте выбор, выбрав одну или несколько групп. Выберите Все, чтобы отобразить все спектры, совместимые с изображениями.
- Спектральная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были сделаны с помощью рабочей станции Mantra с спектральной библиотекой, созданной с помощью программного обеспечения inForm Image Analysis.- Захватите изображение слайдов, окрашенных одним антителом, с помощью соответствующих эпифлуоресцентных фильтров, как предложено в таблице 2 (например, DAPI, флуоресцеин изотиоцианат [FITC], CY3, Texas Red и CY5) с помощью рабочей станции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые фильтры для конкретных флуорофоров, используемых в этом протоколе, приведены в таблице 2. - Определите подходящее время экспозиции для оптимального сигнала, изучив каждый маркер в соответствующем флуоресцентном канале.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный сигнал определяется по ориентиру на позитивность и локализацию, полученному при окрашивании одиночным антителом. - Определить фиксированное время воздействия для каждого анализируемого вещества (комбинация антитело-флуорофор) для стандартизации сравнения перекрестных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение фиксированного воздействия зависит от интенсивности в выборке интересов. - Сканируйте мультиплексные окрашенные слайды в соответствующем режиме сканирования со встроенным алгоритмом автофокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установленная спектральная библиотека будет использоваться для дифференциации мультиспектрального куба изображения на отдельные отдельные компоненты (спектральное размешивание). Это позволило бы обрабатывать цветовую идентификацию всех маркеров, представляющих интерес, с использованием следующих двух основных этапов: учебная сессия и сессия анализа изображений.
- Захватите изображение слайдов, окрашенных одним антителом, с помощью соответствующих эпифлуоресцентных фильтров, как предложено в таблице 2 (например, DAPI, флуоресцеин изотиоцианат [FITC], CY3, Texas Red и CY5) с помощью рабочей станции.
- Анализ изображений
- Подсчет клеток выбранных типов иммунных клеток в эндометрии
- Захватите не менее 10 полей для анализа при 200-кратном увеличении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поля были захвачены путем сканирования всего раздела без какого-либо выбора. Это может обеспечить одновременный захват всех клеточных компонентов эндометрия, например, просветной эпителиальной границы, стромы и желез. - Чтобы подсчитать ячейки, нажмите кнопку «Подсчитать объекты» на панели шагов, чтобы отобразить панель «Параметры подсчета объектов».
- Установите флажок «Отменить объект, если прикоснуться к краю», чтобы исключить любые объекты, касающиеся края изображения, области процесса или области ткани.
- Если ткань сегментирована, выберите категорию тканей, в которой должны быть найдены объекты. Не подсчитывайте объекты за пределами выбранной категории тканей.
- Выберите нужный подход для идентификации объектов: объектно-ориентированный или пиксельный (пороговый).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подход на основе пикселей (порог) следует выбирать в случае надежного или согласованного пятна, для которого применение простого порога даст пиксели объекта. Объектно-ориентированный подход рекомендуется, когда требуются более продвинутые подходы, основанные на морфометрии, в случае отсутствия согласованности и специфичности окрашивания объектов. - Выберите нужное масштабирование сигнала: Автоматическое масштабирование или Фиксированное масштабирование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор автоматического масштабирования приведет к автоматическому масштабированию каждой плоскости компонента перед выполнением сегментации объекта. Параметр «Фиксированное масштабирование» рекомендуется, когда требуется более высокая производительность сегментации, а сигналы пятна являются последовательными и надежными. - Выберите основной компонент для сегментации объектов из раскрывающегося списка.
- Настройте минимальное значение сигнала для основного компонента на требуемое пороговое значение.
- Чтобы автоматически заполнять отверстия в объектах, выберите «Заполнить отверстия».
- Чтобы обнаружить объекты, которые касаются других объектов, как отдельные объекты, а не как один объект, установите флажок Уточнить разделение после установки флажка Максимальный размер (пикселы).
- Чтобы исключить объекты на основе округлости объекта, установите флажок Округлость и укажите требуемую минимальную цикличность.
- Подсчитайте все стромальные клетки (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−и DAPI+),включая клетки, окружающие кровеносные сосуды.
- Подсчитывайте иммунные клетки отдельно, включая Т-клетки (CD3+ и DAPI+),В-клетки (CD20+ и DAPI+),макрофаги (CD68+ и DAPI+) и uNK-клетки (CD56+ и DAPI+).
- Экспрессируйте данные в процентах иммунных клеток относительно общего количества стромальных клеток для каждого захваченного изображения и сообщайте окончательное количество клеток как среднее значение всех полей.
- Используйте редактор представлений для просмотра результирующих таблиц данных после обработки. Экспортируйте таблицу Count Data.
- Количественная оценка пространственного распределения иммунных клеток эндометрия
- При 200-кратном увеличении оцените L-функцию с помощью программы R для диапазона 0-20 мкм, считающегося максимальным расстоянием контакта клетки с клеткой14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения L-функции использовался набор инструментов языка R 'spatstat'.- Обозначают уровень кластеризации различных пар иммунных клеток на основе площади под кривой (AUC) их L-функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий схематический процесс выполнения 4-цветного мультиплексного анализа для выявления 4 типов иммунных клеток эндометрия показан на рисунке 1. Короче говоря, протокол для этого мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания требовал 8 ключевых этапов: 1. Подготовка слайда, 2. Извлечение эпитопа, 3. Блокирование, 4. Первичное применение антител, 5. Применение вторичных антител, 6. Усиление сигнала, 7. Удаление антител и 8. Контрокрашивание и крепление. Затем рендеринг и анализ изображений проводились с использованием рабочей станции Mantra Workstation со спектральной библиотекой, сгенерированной с использованием программного обеспечения inForm Image Analysis для дифференциации 4 типов иммунных клеток в образце эндометрия(рисунок 2).
Четыре типа иммунных клеток эндометрия могут быть идентифицированы в образцах эндометрия человека с использованием этого метода мультиплексного окрашивания: CD3 + Т-клетки, CD20 + В-клетки, CD68 + макрофаги и CD56 + uNK-клетки(рисунок 3). Тем не менее, флуорофорная интерференция должна быть тщательно продумана, чтобы получить четкое и полезное изображение. Хотя эта мультиспектральная технология, использующая рабочую станцию Mantra, может поддерживать до 8-плексных анализов, применение 4 флуорофоров, используемых в этом протоколе, продемонстрировало оптимальную производительность без флуорофорных помех из-за различий в спектрах излучения флуорофоров. Напротив, мультиплексное окрашивание с участием 5-8 флуорофоров часто требует большего внимания к флуорофорной интерференции, возникающей в результате излучения от общих длин волн.
Чтобы преодолеть этот недостаток, моноплексное окрашивание было бы необходимо для определения порядка каждого антитела в мультиплексе и определения уровня экспрессии и рисунка каждого иммунного маркера в образце эндометрия. Это может помочь определить последовательность окрашивания маркеров и связанные с ними пары флуорофоров TSA. После того, как моноплексный анализ был завершен для определения порядка применения антител, следующим шагом будет выбор флуорофора для обнаружения после мультиплексного окрашивания. Уникальный флуорофор должен быть выбран для каждого интересующего антитела. Число, относящееся к каждому флуорофору, будет примерно равно флуоресцентной длине волны, излучаемой во время возбуждения(таблица 1 и таблица 2). Одним из подходов к предотвращению флуорофорной интерференции является выбор пар флуорофоров с длинами волн как можно дальше друг от друга (особенно для колокализующих антител). Это может помочь уменьшить избыточное спектральное перекрытие и обеспечить четкое изображение и более надежное фенотипирование. Кроме того, тщательная оценка путем включения и выключения лазеров из мультиплексного композитного изображения в программном обеспечении inForm также может помочь распознать паттерны окрашивания, чтобы свести к минимуму насыщение флуорофоров(рисунок 4).
Для анализа изображений количество CD3+ Т-клеток, CD20+ В-клеток, CD68+ макрофагов, CD56+ uNK-клеток и стромальных клеток в строме эндометрия (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− и DAPI-окрашенных) может быть подсчитано автоматически с помощью программного обеспечения inForm Tissue Finder 14.0(рисунок 5). Плотность каждого типа иммунных клеток выражалась в процентах относительно общего числа стромальных клеток(рисунок 5). Аналогичным образом, количественная оценка пространственного распределения иммунных клеток эндометрия была основана на положении X и Y каждой отдельной иммунной клетки, полученной из системы InForm(рисунок 6). Используя R-язык, можно затем различить уровень кластеризации различных пар иммунных клеток на основе AUC.
Рисунок 1:Схема рабочего процесса окрашивания. Сокращения: BSA = бычий сывороточный альбумин; HRP = пероксидаза хрена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Рабочая станция для захвата и анализа изображений. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) необработанное спектральное изображение, (C) композитное изображение, (D) сегментация тканей (эпителиальные и стромальные компартменты), (E) составное изображение ткани эндометрия, показывающее четыре цветных маркера для идентификации различных клеточных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Спектральная визуализация. Мультиплексное иммуноокрашивание 4 различных типов иммунных клеток проводилось на биопсии эндометрия от(А)фертильной контрольной женщины и(В)женщины с необъяснимым РМ, представленной как единичная мультиспектральная визуализация. После создания библиотеки с одним окрашиванием спектральное размешивание может выявить изображение одиночных флуорофоров, представляющих(C)CD3,(D)CD56,(E)CD68,(F)CD20,(G)DAPI. Затем было создано составное изображение путем включения всех флуорофоров после мультиспектральной визуализации(H). Шкала стержней = 50 мкм(A, B). Сокращения: LE = люминальный эпителий; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; RM = повторяющийся выкидыш. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Инструмент InForm Counts. Инструмент подсчета программного обеспечения inForm активируется путем выбора значка бежевого поля (обозначенного ↓). (A)Подготовка изображений,(B, C)сегментация ткани для рисования от руки и автоматизации,(D)сегментация отдельных клеток,(E)фенотипирование клеток на основе интенсивности флуорофора,(F)анализ интенсивности флуорофора (красное поле, показывающее количество положительных клеток в выбранной интенсивности флуорофора), и(G)экспорт результатов для использования (красное поле указывает на варианты экспорта). Аббревиатура: IHC = иммуногистохимический. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Подсчет клеток. (A)Фенотипирование клеток для автоматического подсчета клеток и(B)вывода положительно окрашенных клеток в сегментированную область (например, стромальную) для дальнейшего сравнения и статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Измерение пространственной плотности. (A)Автоматическое обнаружение положения положительно окрашенных иммунных клеток в сегментированной области (например, стромальной),(B)выходное отображение координаты каждой положительно окрашенной CD20+ иммунной клетки и(C)определение пространственной плотности и локализации между CD20+ клетками и другими иммунными клетками в сегментированных областях ткани с помощью Spatstat. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Порядок | Антитело | Клон | Клональность | Фактор разбавления антител | Опалы | Фактор разбавления опала |
| 1 | СД3 | Пакет обновления 7 (SP7) | Моноклональный | 1 из 100 | Опал 620 | 0.111111111 |
| 2 | СД20 | Л26 | Моноклональный | 1 из 100 | Опал 650 | 0.215277778 |
| 3 | СД68 | ПАКЕТ ОБНОВЛЕНИЯ 251 (SP251) | Моноклональный | 1 из 100 | Опал 520 | 0.111111111 |
| 4 | СД56 | СД564 | Моноклональный | 1 из 100 | Опал 690 | 0.111111111 |
Таблица 1: Список используемых антител, клонов и концентраций.
| Краска | Максимальное возбуждение (нм) | Максимальный выброс (нм) | Ожидаемое обнаружение в наборе фильтров (имя) | Ожидаемый цвет |
| ДАПИ | 350 | 470 | ДАПИ | Синий |
| Опал 520 | 494 | 525 | ФИТК | Зеленый |
| Опал 620 | 588 | 616 | Cy3 и Техас Ред | Янтарь |
| Опал 650 | 627 | 650 | Техас Ред и Cy5 | Апельсин |
| Опал 690 | 676 | 694 | Техас Ред и Cy5 | Ясный |
Таблица 2: Список флуорофоров с их максимальными длинами волн возбуждения и излучения, ожидаемым обнаружением в соответствующих наборах фильтров и наблюдаемыми цветами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках протокола
Важно отметить, что мультиплексное окрашивание требует тщательной оптимизации. Извлечение антигена с использованием цитратного буфера и микроволновой технологии требует оптимизации для обеспечения полного удаления антител и поддержания жизнеспособности тканей. Поскольку реагенты TSA ковалентно связываются с сайтами, окружающими антиген, они могут потенциально ингибировать связывание последующего первичного антитела через стерическое препятствие (также известное как «зонтичный эффект»). Это, как правило, происходит, когда несколько иммунных маркеров находятся в одном клеточном компартменте и вызывают флуорофорную интерференцию. Чтобы определить, будет ли эффект, было бы важно заранее выполнить моноплекс IHC / IF, чтобы выявить любое перекрытие в локализации иммунных клеток. Поскольку для создания спектральной библиотеки потребуется окрашивание одного образца, проверенные библиотеки спектров могут облегчить распознавание отдельных сигналов для дальнейшего предотвращения флуорофорных помех. При необходимости концентрации первичных антител и время инкубации, сопряжение флуорофора с антителом, концентрации флуорофора TSA и порядок окрашивания могут быть изменены для минимизации флуорофорной интерференции. Кроме того, важно правильно сбалансировать концентрации HRP, чтобы предотвратить образование димера TSA. Это может быть достигнуто путем титрования первичных и вторичных антител. Кроме того, жизненно важно помнить, что концентрации и время инкубации первичных антител, используемых для мультиплексного окрашивания, могут отличаться от тех, которые используются при обычном хромогенном одиночном окрашивании. Следовательно, определение концентрации и порядка применения антител для мультиплексного окрашивания должно проводиться заранее.
Изменения и устранение неполадок
В этом исследовании мы использовали мультиплексное флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание для одновременного обнаружения взаимодействия четырех основных типов иммунных клеток в биопсии эндометрия у женщин с РМ и без него. Этот метод использует антитела против CD3 для Т-клеток, CD20 для В-клеток, CD68 для макрофагов и CD56 для клеток uNK, чтобы различать эти типы клеток. Основываясь на этом методе, мы обнаружили, что медиана CD3+,CD68+и CD56+ значения плотности клеток у женщин с РМ были значительно выше, чем у фертильных контрольныхгрупп 15. Кластеризация между клетками CD56+ uNK и CD68+ макрофагами была значительно выше в группе RM, чем в фертильной контрольной группе. Кроме того, использование этого метода показало, что клетки CD56+ uNK, по-видимому, имеют как числовую, так и пространственную корреляцию с CD68+ макрофагами в обеих группах женщин. Напротив, CD56+ uNK-клетки имеют значительную числовую, но не пространственную корреляцию с CD3+ Т-клетками у женщин с RM15. Этот метод также определяет пространственные отношения нескольких типов иммунных клеток в эндометрии. Однако позитивность для конкретного маркера в некоторых случаях может быть пограничной. Для преодоления этой проблемы целесообразно включить положительный контроль и отрицательный контроль для определения порога позитивности при построении спектральной библиотеки. Кроме того, тщательная оценка путем включения и выключения лазеров из мультиплексного композитного изображения в программном обеспечении inForm также может помочь распознать шаблоны окрашивания, чтобы свести к минимуму насыщение флуорофора.
Ограничения техники
Идентификация флуорофорной интерференции при интерпретации данных имеет важное значение для дифференциации между подлинной колокализацией маркеров и несмешиваемыми артефактами. Эта методология мультиплексного окрашивания использует реагенты на основе TSA, управляемые ферментативной амплификацией, которая может повысить интенсивность маркера антигена в 10-100 раз по сравнению с обычными непрямыми методами ПЧ. Это создает риск сверхактивного осаждения тирамида, что может привести к эффекту зонтика и/или просачиванию сигнала. Чтобы определить чрезмерное загрязнение, уровни сигнала могут быть визуально оценены путем несмешивания изображений в inForm и наведения курсора на яркие, положительные области на мультиплексном изображении ткани. Уровни сигнала обычно должны оставаться ниже 30 и в идеале в пределах коэффициента 3 друг от друга, особенно для спектрально смежных флуорофоров. Более чем 5-кратные различия в сигналах для спектрально смежных флуорофоров могут привести к флуорофорной интерференции и вызвать несмешивание артефактов. Если уровни сигнала любого флуорофора показывают более чем в 3 раза большую разницу с соседним флуорофором, концентрации флуорофора TSA необходимо скорректировать для достижения баланса сигнала. Как только будет подтверждено, что сигнал находится в правильном диапазоне, отношение сигнал/фон должно поддерживаться на уровне <1:10, чтобы гарантировать, что положительное окрашивание не будет ложно обнаружено на неспецифическом фоне.
Поскольку спектральные перекрестные помехи могут также создавать значительные флуорофорные интерференции, порядок окрашивания должен быть скорректирован для разделения спектрально смежных красителей как в последовательности, так и в выражении маркеров. Хотя эта мультиспектральная технология с использованием mantra Workstation поддерживает до 8-плексных анализов, применение 4 флуорофоров, а именно Opal 520, 540, 620 и 690, демонстрирует наилучшую производительность без флуорофорных помех. Использование флуорофоров ≥5 часто требует большей оптимизации и проверки, чтобы избежать спектральных перекрестных помех из-за спектральных профилей флуорофоров, которые разделяют близкие длины волн. Другими словами, количество целей, которые могут быть обнаружены одновременно с помощью этого подхода, ограничено только количеством диапазонов длин волн и доступных наборов фильтров возбуждения/излучения. Следовательно, чтобы исключить потенциальное чрезмерное загрязнение флуорофора TSA, которое блокирует дальнейшее применение других флуорофоров TSA и / или идентифицировать перекрестные помехи сигнала, важно быть тщательным, включая и выключая слои из мультиплексного композитного изображения в программном обеспечении inForm; правильная интерпретация рисунков окрашивания из одного окрашивания IHC; и поиск очевидных потерь, усиления или идентичных сигналов в одной плоскости, соответствующих локализации в другой плоскости.
Мультиспектральное окрашивание требует антител в паре со специфическими флуорофорами для одновременного обнаружения нескольких маркеров. Это соединение флуорофор-антитело следует двум правилам: i) флуорофоры, назначенные для совместно экспрессированных маркеров, должны быть спектрально разделены, и ii) более обильные мишени должны быть сопряжены с флуорофорами с более низкой яркостью или наоборот. Порядок окрашивания также должен быть организован таким образом, чтобы последовательные антитела не солидаризировались в одних и тех же клеточных компартментах в окрашенных клетках. Поэтому, помимо концентраций антител и времени инкубации, которые являются критическими факторами в обычных методах окрашивания, для успешного мультиплексного окрашивания необходимо учитывать дополнительные параметры, такие как соответствующее сопряжение флуорофор-антитело, концентрации флуорофора TSA, последовательность окрашивания и воздействие конкретного антитела на одну или несколько микроволновых процедур. Из-за высокой изменчивости исследуемых образцов данный мультиплексный протокол может не генерировать тот же результат в других типах исследуемых образцов.
Весь процесс последовательного окрашивания опалового мультиплекса может занять от одного до нескольких дней в зависимости от количества маркеров, участвующих в панели, и времени инкубации первичных антител. Напротив, стандартные методы ПЧ обычно позволяют визуализировать 4-5 маркеров за один раунд окрашивания. Следует отметить, что условия, оптимизированные с использованием обычного метода IHC, нуждаются в дальнейшей оптимизации, прежде чем переходить к процедурам мультиплексного окрашивания, которые включают в себя дополнительные, множественные микроволновые обработки и применение флуорофоров TSA, которые в конечном итоге повлияют на интенсивность окрашивания каждого антитела. В настоящее время подходы к визуализации, использующие мультиспектральные технологии, могут потребовать дорогостоящих и специализированных приборов. Кроме того, он может быть ограничен только выбранными изображениями областями, представляющими интерес. Следовательно, это может быть неоптимальным для лабораторий с ограниченными ресурсами и разведкой тканей с неопределенными антигенными мишенями.
Значение по отношению к существующим методам
Особой силой этого современного метода является способность измерять плотность нескольких типов иммунных клеток в эндометрии одновременно, в отличие от обычных методов IHC, которые могут маркировать только один-два типа клеток в одном участке ткани. Проточная цитометрия является еще одним методом, который может анализировать относительные пропорции различных типов иммунных клеток в образце эндометрия; однако он не сможет предоставить пространственную информацию между различными типами иммунных клеток и специфическое распределение в различных компартментах эндометрия. Кроме того, истощение тканей является серьезной проблемой в клинической практике, особенно во время клинических испытаний и при использовании образцов биопсии. Эти два традиционных метода потребуют большого количества образцов (либо секций, либо клеток) для оптимизации процедуры и обнаружения нескольких типов иммунных клеток в эндометрии женщин с РМ и без него.
Как описано в этом протоколе, рабочий процесс Opal предназначен для обнаружения до семи маркеров в одном и том же участке ткани с помощью рабочей станции Mantra. Кроме того, перекрестная реактивность видов при отборе антител не является ограничением данной технологии. Действительно, преимущество этой технологии заключается в том, что она позволяет использовать антитела, выращенные у одного вида, для обнаружения до семи маркеров. Этот подход включает в себя обнаружение с помощью флуоресцентных реагентов TSA с последующей микроволновой обработкой для удаления любых неспецифических окрашиваний. После зачистки на основе микроволновой печи может быть выполнен еще один раунд окрашивания для дополнительного обнаружения цели без риска перекрестной реактивности антител. Кроме того, этот метод обнаружения TSA может быть выполнен как минимум за 3 дня, чтобы объединить до 7 фторхромов, в то же время давая надежные результаты для обнаружения белковых мишеней с низкой экспрессией. Еще одним преимуществом мультиплексного окрашивания по сравнению с традиционным исследованием IHC является его повышенная эффективность, поскольку измерение автоматизировано, что может устранить субъективную предвзятость. Полученные количественные данные представляют собой конечные результаты анализа.
Будущие приложения
Диапазон применения этого мультиплексного протокола огромен. Важно отметить, что это первая статья, описывающая метод обнаружения экспрессии мультиплексированного иммунофлуоресцентного маркера с использованием рабочей станции Mantra и анализа изображений с использованием программного обеспечения InForm 2.2.1 для обеспечения точных и воспроизводимых результатов в дифференциации нескольких популяций иммунных клеток у женщин с РМ и без него. Важно отметить, что локализация нескольких мишеней в одном и том же участке ткани может обеспечить уникальное понимание их клеточных взаимодействий. В конечном счете, это приведет к лучшему пониманию микроокружения иммунных клеток во время имплантации эмбриона у женщин с РМ для установления специфического целевого лечения.
Более того, наши текущие методы помогли продемонстрировать, что несколько иммунных клеток и их взаимодействия могут быть важны для функции эндометрия. Об этом свидетельствуют значительные изменения плотности трех из четырех типов иммунных клеток эндометрия и значительное увеличение кластеризации между клетками CD68+ и CD56+. И наоборот, аномальные взаимодействия этих типов иммунных клеток могут быть предрасполагающими факторами для РМ. Важно отметить, что в отличие от обнаружения одного подтипа иммунных клеток эндометрия, применение этого мультиплексного окрашивания IHC может обеспечить глубокое понимание иммунологической регуляции имплантации эмбриона. Кроме того, количественная оценка и дальнейшее понимание пространственных особенностей в иммунной микросреде может помочь пролить свет на биологию этого заболевания в контексте иммунотерапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Гонконгским акушерско-гинекологическим трастовым фондом в 2018 году и Гонконгским фондом здравоохранения и медицинских исследований (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
