Multiplexerad fluorescerande immunohistokemisk färgning av fyra endometrie immuncelltyper vid återkommande missfall
Summary
Trots framstegen inom multiplex immunohistochemistry och multispektral imaging, känneteckna densitet och kluster av stora immunceller samtidigt i livmoderslemhinnan är fortfarande en utmaning. Detta dokument beskriver en detaljerad multiplex färgning protokoll och imaging för samtidig lokalisering av fyra immun cell typer i livmoderslemhinnan.
Abstract
Immunohistokemi är den vanligaste metoden för identifiering och visualisering av vävnadsantigener inom biologisk forskning och klinisk diagnostik. Det kan användas för att karakterisera olika biologiska processer eller patologier, såsom sårläkning, immunsvar, vävnadsavstötning och vävnad-biomaterial interaktioner. Visualisering och kvantifiering av flera antigener (särskilt för immunceller) i en enda vävnad avsnitt med konventionella immunohistochemical (IHC) färgning är dock fortfarande otillfredsställande. Därför introducerades multiplexerad teknik under de senaste åren för att identifiera flera biologiska markörer i ett enda vävnadsprov eller en ensemble av olika vävnadsprover.
Dessa tekniker kan vara särskilt användbara för att skilja förändringarna i immun cell-till-cell interaktioner inom livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med återkommande missfall under implantation. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för multiplexed fluorescence IHC färgning att undersöka densitet och kluster av fyra stora immun celltyper samtidigt i exakt tidsbestämma endometrie exemplar under embryo implantation. Metoden inkluderar provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys, med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller.
Med denna metod kan densiteten och klustring av fyra stora immuncelltyper i livmoderslemhinnan samtidigt analyseras i en enda vävnadssektion. Dessutom kommer detta dokument att diskutera de kritiska faktorerna och felsökningen för att övervinna eventuella fluoroforstörningar mellan de fluorescerande sonder som appliceras. Viktigt är att resultaten från denna multiplexfärgningsteknik kan bidra till att ge en djupgående förståelse för den immunologiska interaktionen och regleringen under embryoimplantation.
Introduction
Återkommande missfall (RM) kan definieras som förlust av två eller flera graviditeter före 24 veckors graviditet1. Detta frekventa reproduktiva tillstånd påverkar upp till 1% av par över hela världen2,3. Patofysiologi är multifaktoriell och kan delas in i embryologiskt drivna orsaker (främst på grund av en onormal embryonal karyotyp) och moderns drivna orsaker som påverkar livmoderslemhinnan och/eller placental utveckling. Denna manifestation kan bero på föräldrarnas genetiska avvikelser, livmoderavvikelser, protrobotiska tillstånd, endokrinologiska faktorer och immunologiska störningar4.
Under de senaste åren har immuneffektorcelldysfunktion varit inblandad i patogenesen vid tidig graviditetsförlust5. Detta har inspirerat många undersökningar för att klargöra de specifika populationerna av immunceller i livmoderslemhinnan under menstruationscykeln, implantation och tidig graviditet, med specifika roller i tidig graviditet. Bland dessa immunceller spelar livmoderns naturliga mördarceller (uNK) en kritisk roll under embryoimplantation och graviditet, särskilt i processerna för trofolastisk invasion och angiogenes6. Studier har visat en ökad uNK celltäthet i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM7,8, även om detta fynd inte var förknippat med en ökad risk för missfall9. Detta stimulerade dock forskning som utvärderade densiteten hos andra immuncelltyper (såsom makrofager, livmoder dendritiska celler) i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM10,11. Det är dock fortfarande osäkert om det finns en betydande förändring i immuncellens densitet i peri-implantation endometrium hos kvinnor med RM.
En möjlig förklaring till osäkerheten är att utvärdering av endometrie immuncell densitet kan vara svårt på grund av de snabba förändringarna i livmoderslemhinnan under fönstret av implantation. Under tidsramen på 24 timmar förändrar signifikanta förändringar i endometrium immuncellens densitet och cytokinsekreation, vilket introducerar en källa till variation i dessa resultat12. Dessutom är de flesta rapporter huvudsakligen beroende av användning av encellsfärgning (t.ex. traditionella IHC-metoder) som inte kunde undersöka flera markörer på samma vävnadssektion. Även om flödescytometri kan användas för att upptäcka flera cellpopulationer i ett enda prov, hindrar de stora mängder celler som krävs och den tidskrävande optimeringen populariteten och effektiviteten hos denna metod. Därför kan den senaste utvecklingen i multiplex IHC färgning lösa detta problem genom att immunstaining flera markörer på samma bild för att utvärdera flera parametrar, inklusive cell härstamning och histologiska lokalisering av enskilda immun subpopulationer. Vidare kan denna teknik maximera den information som erhålls vid begränsad vävnad tillgänglighet. I slutändan kan denna teknik hjälpa till att klargöra skillnaderna i immuncellinteraktioner i livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med RM.
Två grupper av kvinnor rekryterades från Prince of Wales Hospital, inklusive fertila kontroll kvinnor (FC) och kvinnor med oförklarliga återkommande missfall (RM). Fertil kontroll definierades som kvinnor som hade minst en levande födsel utan någon historia av spontana missfall, och RM kvinnor definierades som de som hade en historia av ≥2 på varandra följande missfall före 20 veckor dräktighet. Försökspersonerna från de två grupperna uppfyllde följande inklusionskriterier: a) ålder mellan 20 och 42 år, b) icke-rökare, c) regelbunden menstruationscykel (25-35 dagar) och normal livmoderstruktur, d) ingen användning av någon hormonell regim under minst 3 månader före endometriebiopsi, e) ingen hydrosalpinx med hystero-salpingogram. Dessutom hade alla ämnen som rekryterats normala karyotypning, normala 3-dimensionella ultrasonography hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerande hormon 30 nmol/L, normala sköldkörteln funktion och testat negativt för lupus antikoagulantia och antikardiolipin IgG och IgM antikroppar.
För att bättre förstå den immunologiska grunden för RM, skulle det vara mest önskvärt att samtidigt kvantifiera och lokalisera de stora immuncelltyperna som finns i livmoderslemhinnan vid implantationstillfället. Detta dokument beskriver hela protokollet från provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller. Dessutom beskriver detta dokument hur man bestämmer densiteten och klustring av immuncelltyperna samtidigt i livmoderslemhinnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att notera att multiplexfärgning kräver noggrann optimering. Antigenhämtning, med hjälp av citratbuffert och mikrovågsteknik, kräver optimering för att säkerställa fullständig antikroppsborttagning och upprätthålla vävnadens livskraft. Eftersom TSA-reagenser kovalent binder till platser som omger antigenet kan de potentiellt hämma bindningen av en efterföljande primär antikropp genom steriskt hinder (även känt som “paraplyeffekten”). Detta …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund 2018 och Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
