Coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée de quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre lors d’une fausse couche récurrente
Summary
Malgré les progrès de l’immunohistochimie multiplexe et de l’imagerie multispectrale, caractériser la densité et le regroupement simultané des principales cellules immunitaires dans l’endomètre reste un défi. Cet article décrit un protocole de coloration multiplex détaillé et une imagerie pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l’endomètre.
Abstract
L’immunohistochimie est la méthode la plus couramment utilisée pour l’identification et la visualisation des antigènes tissulaires dans la recherche biologique et le diagnostic clinique. Il peut être utilisé pour caractériser divers processus biologiques ou pathologies, tels que la cicatrisation des plaies, la réponse immunitaire, le rejet tissulaire et les interactions tissu-biomatériau. Cependant, la visualisation et la quantification de plusieurs antigènes (en particulier pour les cellules immunitaires) dans une seule section de tissu à l’aide d’une coloration immunohistochimique conventionnelle (IHC) restent insatisfaisantes. Par conséquent, des technologies multiplexées ont été introduites ces dernières années pour identifier plusieurs marqueurs biologiques dans un seul échantillon de tissu ou un ensemble d’échantillons de tissus différents.
Ces technologies peuvent être particulièrement utiles pour différencier les changements dans les interactions cellules-à-cellule immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes ayant des fausses couches récurrentes pendant l’implantation. Cet article décrit un protocole détaillé pour la coloration IHC par fluorescence multiplexée afin d’étudier la densité et le regroupement simultanément de quatre principaux types de cellules immunitaires dans des échantillons d’endomètre chronométrés avec précision lors de l’implantation d’embryons. La méthode comprend la préparation des échantillons, l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et le balayage des lames, suivi de l’analyse des données, avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre.
En utilisant cette méthode, la densité et le regroupement de quatre principaux types de cellules immunitaires dans l’endomètre peuvent être analysés simultanément dans une seule section de tissu. En outre, cet article traitera des facteurs critiques et du dépannage pour surmonter les interférences possibles de fluorophores entre les sondes fluorescentes appliquées. Il est important de noter que les résultats de cette technique de coloration multiplex peuvent aider à fournir une compréhension approfondie de l’interaction immunologique et de la régulation lors de l’implantation embryonnaire.
Introduction
Une fausse couche récurrente (RM) peut être définie comme la perte de deux grossesses ou plus avant 24 semaines de gestation1. Cette condition de reproduction fréquente affecte jusqu’à 1% des couples dans le monde2,3. La physiopathologie est multifactorielle et peut être divisée en causes embryologiques (principalement dues à un caryotype embryonnaire anormal) et causes maternelles qui affectent l’endomètre et / ou le développement placentaire. Cette manifestation peut résulter d’anomalies génétiques parentales, d’anomalies utérines, de conditions prothrombotiques, de facteurs endocrinologiques et de troubles immunologiques4.
Ces dernières années, un dysfonctionnement des cellules effectrices immunitaires a été impliqué dans la pathogenèse de la perte de grossesse précoce5. Cela a inspiré de nombreuses recherches pour élucider les populations spécifiques de cellules immunitaires dans l’endomètre pendant le cycle menstruel, l’implantation et le début de la grossesse, avec des rôles spécifiques en début de grossesse. Parmi ces cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle essentiel lors de l’implantation embryonnaire et de la grossesse, en particulier dans les processus d’invasion trophoblastique et d’angiogenèse6. Des études ont montré une augmentation de la densité cellulaire uNK dans l’endomètre des femmes atteintes de RM7,8, bien que cette découverte n’ait pas été associée à un risque accru de fausse couche9. Cependant, cela a stimulé la recherche évaluant la densité d’autres types de cellules immunitaires (telles que les macrophages, les cellules dendritiques utérines) dans l’endomètre chez les femmes atteintes de RM10,11. Néanmoins, il n’est pas certain qu’il y ait une altération significative de la densité des cellules immunitaires dans l’endomètre péri-implantatoire chez les femmes atteintes de RM.
Une explication possible de l’incertitude est que l’évaluation de la densité des cellules immunitaires de l’endomètre pourrait être difficile en raison des changements rapides dans l’endomètre pendant la fenêtre d’implantation. Au cours de la période de 24 heures, des changements importants dans l’endomètre modifient la densité des cellules immunitaires et la sécrétion de cytokines, introduisant une source de variation dans ces résultats12. De plus, la plupart des rapports reposent principalement sur l’utilisation de la coloration unicellulaire (p. ex., les méthodes traditionnelles de LSI) qui ne pouvaient pas examiner plusieurs marqueurs sur la même section de tissu. Bien que la cytométrie en flux puisse être utilisée pour détecter plusieurs populations cellulaires dans un seul échantillon, les grandes quantités de cellules nécessaires et l’optimisation fastidieuse entravent la popularité et l’efficacité de cette méthode. Par conséquent, les progrès récents dans la coloration multiplexE de l’IHC pourraient résoudre ce problème en immunocolorant plusieurs marqueurs sur la même diapositive pour évaluer plusieurs paramètres, y compris la lignée cellulaire et la localisation histologique de sous-populations immunitaires individuelles. De plus, cette technologie peut maximiser les informations obtenues en cas de disponibilité limitée des tissus. En fin de compte, cette technique peut aider à élucider les différences dans les interactions des cellules immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes atteintes de RM.
Deux groupes de femmes ont été recrutés à l’Hôpital Prince of Wales, y compris les femmes témoins fertiles (FC) et les femmes ayant une fausse couche récurrente inexpliquée (RM). Le contrôle fertile a été défini comme les femmes qui avaient au moins une naissance vivante sans antécédents de fausse couche spontanée, et les femmes RM ont été définies comme celles qui avaient des antécédents de ≥2 fausses couches consécutives avant 20 semaines de gestation. Les sujets des deux groupes répondaient aux critères d’inclusion suivants : (a) âge entre 20 et 42 ans, (b) non-fumeur, (c) cycle menstruel régulier (25-35 jours) et structure utérine normale, (d) pas d’utilisation d’un régime hormonal pendant au moins 3 mois avant la biopsie de l’endomètre, (e) pas d’hydrosalpinx par hystéro-salpingogramme. En outre, tous les sujets recrutés avaient un caryotypage normal, une échographie 3 dimensions normale, un hystérosalpingographie en 3 dimensions, une hormone folliculo-stimulante du jour 2 30 nmol / L, une fonction thyroïdienne normale et des anticorps anticoagulants lupiques et anticorps IgG et IgM anticardiolipine.
Pour mieux comprendre la base immunologique de la RM, il serait plus souhaitable de quantifier et de localiser simultanément les principaux types de cellules immunitaires présentes dans l’endomètre au moment de l’implantation. Cet article décrit l’ensemble du protocole, de la préparation des échantillons à l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et au balayage des lames, suivi de l’analyse des données avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre. De plus, cet article décrit comment déterminer la densité et le regroupement des types de cellules immunitaires simultanément dans l’endomètre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole
Il est important de noter que la coloration multiplex nécessite une optimisation diligente. La récupération d’antigènes, à l’aide de la technologie du tampon de citrate et des micro-ondes, nécessite une optimisation pour assurer un décapage complet des anticorps et maintenir la viabilité des tissus. Comme les réactifs de la TSA se lient de manière covalente aux sites entourant l’antigène, ils peuvent potentiellement inhiber la liaison d’un anticorps pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund en 2018 et le Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
