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Biology

क्षेत्र में माइटोकॉन्ड्रियल एनर्जेटिक को मापने के लिए एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला का विकास

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62956
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 3, 1
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

Summary

हमने क्षेत्र स्थानों पर पकड़े गए जंगली जानवरों के पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में श्वसन दर को मापने के लिए एक मोबाइल प्रयोगशाला का डिजाइन और निर्माण किया। यहां, हम एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल प्रयोगशाला और संबंधित प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के डिजाइन और आउटफिटिंग का वर्णन करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान पशु जैव रसायन और शरीर विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, जिसमें शोधकर्ता चयापचय क्षमता की जांच के लिए मीट्रिक के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का उपयोग करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के उपायों को प्राप्त करने के लिए, ताजा जैविक नमूनों का उपयोग किया जाना चाहिए, और पूरी प्रयोगशाला प्रक्रिया लगभग 2 घंटे के भीतर पूरी होनी चाहिए। इसके अलावा, इन प्रयोगशाला परखों को करने के लिए विशेष उपकरणों के कई टुकड़ों की आवश्यकता होती है। यह शरीर विज्ञान प्रयोगशालाओं से दूर रहने वाले जंगली जानवरों के ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए एक चुनौती बनाता है क्योंकि क्षेत्र में संग्रह के बाद जीवित ऊतक को बहुत लंबे समय तक संरक्षित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, लंबी दूरी पर जीवित जानवरों का परिवहन तनाव को प्रेरित करता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान को बदल सकता है।

यह पांडुलिपि ऑबर्न यूनिवर्सिटी (एयू) मिटोमोबाइल का परिचय देती है, जो एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला है जिसे क्षेत्र में ले जाया जा सकता है और जंगली जानवरों से एकत्र किए गए ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय को मापने के लिए साइट पर उपयोग किया जा सकता है। मोबाइल प्रयोगशाला की बुनियादी विशेषताएं और पृथक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापने के लिए चरण-दर-चरण विधियां प्रस्तुत की जाती हैं। इसके अतिरिक्त, प्रस्तुत डेटा मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला को फिट करने और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप बनाने की सफलता को मान्य करता है। मोबाइल प्रयोगशाला की नवीनता क्षेत्र में ड्राइव करने और साइट पर कैप्चर किए गए जानवरों के ऊतकों पर माइटोकॉन्ड्रियल माप करने की क्षमता में निहित है।

Introduction

आज तक, माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों या स्थापित फिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं के पास पकड़े गए जानवरों तक सीमित हैं, जिसने वैज्ञानिकों को प्रवासन, डाइविंग और हाइबरनेशन 1,2,3,4,5,6 जैसी गतिविधियों के दौरान जानवरों से एकत्र किए गए ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक अध्ययन करने से रोक दिया है।. जबकि कई जांचकर्ताओं ने जंगली जानवरों के बेसल और पीक चयापचय दर और दैनिक ऊर्जा व्ययको सफलतापूर्वक मापा है 7,8, माइटोकॉन्ड्रिया के प्रदर्शन को मापने के लिए शोधकर्ताओं की क्षमता सीमित रही है (लेकिनदेखें 1,4,9). यह आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए ताजा ऊतक की आवश्यकता और ताजा ऊतक प्राप्त करने के लगभग 2 घंटे के भीतर अलगाव करने के लिए एक प्रयोगशाला सुविधा के कारण है। एक बार माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप भी ~ 1 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।

पृथक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर आमतौर पर क्लार्क इलेक्ट्रोड से जुड़े एक सील कंटेनर में ऑक्सीजन एकाग्रता को मापकर की जाती है। इस विधि के पीछे सिद्धांत बुनियादी अवलोकन पर स्थापित है कि ऑक्सीजन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है। इसलिए, जैसा कि एक प्रयोग के दौरान ऑक्सीजन एकाग्रता गिरती है, यह माना जाता है कि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन10 होता है। खपत ऑक्सीजन उत्पादित एटीपी के लिए एक प्रॉक्सी है। शोधकर्ता विभिन्न सब्सट्रेट्स का उपयोग करके विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियां बना सकते हैं और कक्ष में एडीपी की पूर्व निर्धारित मात्रा को जोड़कर एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) -उत्तेजित श्वसन (राज्य 3) शुरू कर सकते हैं। एक्सोजेनस एडीपी से एटीपी के फॉस्फोराइलेशन के बाद, ऑक्सीजन की खपत दर कम हो जाती है, और राज्य 4 तक पहुंच जाता है और इसे मापा जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट अवरोधकों के अलावा रिसाव श्वसन और अयुग्मित श्वसन के बारे मेंजानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। राज्य 3 से राज्य 4 का अनुपात श्वसन नियंत्रण अनुपात (आरसीआर) निर्धारित करता है, जो समग्र माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन10,11 का संकेतक है। आरसीआर के निम्न मान समग्र माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का संकेत देते हैं, जबकि उच्च आरसीआर मान माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन10 की अधिक सीमा का सुझाव देते हैं।

जैसा कि पहले कहा गया है, जैविक सामग्री का संग्रह, माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव, और श्वसन दर का माप ऊतक प्राप्त करने के 2 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। स्थापित प्रयोगशालाओं में बड़ी दूरी पर जानवरों को परिवहन किए बिना इस कार्य को पूरा करने के लिए, एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला का निर्माण क्षेत्र स्थानों पर ले जाने के लिए किया गया था जहां इन आंकड़ों को एकत्र किया जा सकता है। एक 2018 जेको रेडहॉक मनोरंजक वाहन को एक मोबाइल आणविक शरीर विज्ञान प्रयोगशाला में परिवर्तित कर दिया गया था और इसका नाम ऑबर्न यूनिवर्सिटी (एयू) मिटोमोबाइल (चित्रा 1 ए) रखा गया था। एक मनोरंजक वाहन का चयन अंतर्निहित रेफ्रिजरेटर, फ्रीजर, जल भंडारण टैंक और नलसाजी, 12-वोल्ट बैटरी, गैस जनरेटर, प्रोपेन टैंक और स्व-स्तरीय प्रणाली द्वारा संचालित बिजली के कारण किया गया था। इसके अलावा, मनोरंजक वाहन डेटा संग्रह के लिए रात भर दूरस्थ साइटों पर रहने की क्षमता प्रदान करता है। वाहन के सामने के हिस्से को नहीं बदला गया था और ड्राइविंग और स्लीपिंग क्वार्टर प्रदान करता है (चित्रा 1 बी)। पहले वाहन के पीछे और स्टोवटॉप में स्थापित बेडरूम सुविधाएं (बिस्तर, टीवी और कैबिनेट) को हटा दिया गया था।

कस्टम-निर्मित स्टेनलेस-स्टील शेल्विंग और 80/20 एल्यूमीनियम फ्रेमिंग द्वारा समर्थित एक कस्टम क्वार्ट्ज काउंटरटॉप बेडरूम सुविधाओं और स्टोवटॉप (चित्रा 1 सी) के स्थान पर स्थापित किए गए थे। प्रयोगशाला बेंच डेटा संग्रह के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करती हैं (चित्रा 1 डी)। उपकरण के प्रत्येक टुकड़े (यानी, प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कक्ष, प्लेट रीडर, कंप्यूटर, होमोजिनाइज़र, तराजू, पोर्टेबल अल्ट्रा-फ्रीजर, और अन्य सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति) की बिजली की खपत को ध्यान में रखा गया था। सेंट्रीफ्यूज के बड़े वोल्टेज और वर्तमान मांगों का समर्थन करने के लिए, विद्युत प्रणाली को विमान-ग्रेड उपकरण में अपग्रेड किया गया था। वाहन के पीछे एक बाहरी डिब्बे को तरल नाइट्रोजन भंडारण खाड़ी में परिवर्तित कर दिया गया था, जो तरल नाइट्रोजन भंडारण और परिवहन के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के परिवहन विभाग के दिशानिर्देशों को पूरा करता है। इस भंडारण इकाई का निर्माण स्टेनलेस स्टील के साथ किया गया था और इसमें वाहन के यात्री डिब्बे में किसी भी विस्तारित नाइट्रोजन गैस को लीक करने से रोकने के लिए उचित वेंटिंग है।

यह पुष्टि करने के लिए कि मोबाइल प्रयोगशाला का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक अध्ययनों में किया जा सकता है, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग किया गया था, और जंगली-व्युत्पन्न घर चूहों (मस मस्कुलस) हिंदलिम्ब कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापा गया था। क्योंकि मस मस्कुलस एक मॉडल जीव है, इस प्रजाति की माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर अच्छी तरह से स्थापित12,13,14 है। यद्यपि पिछले अध्ययनों ने अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन15,16,17 के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का दस्तावेजीकरण किया है, मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला विधियों में उपयोग किए जाने वाले तरीकों का एक संक्षिप्त अवलोकन नीचे वर्णित है।

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Protocol

निम्नलिखित खंड माइटोकॉन्ड्रियल प्रयोगशाला विधियों का वर्णन करते हैं। सभी पशु हैंडलिंग और ऊतक संग्रह प्रक्रियाओं को ऑबर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (# 2019-3582) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर का विवरण

नोट: इन बफर को एक स्थिर प्रयोगशाला में तैयार किया जा सकता है और क्षेत्र यात्रा से पहले मोबाइल प्रयोगशाला में ले जाया जा सकता है (जब तक कि अन्यथा नीचे उल्लेख न किया गया हो)।

  1. बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में देखा गया है।
    1. फैटी एसिड मुक्त बीएसए को छोड़कर विआयनीकृत पानी (~ 90% मात्रा) में रसायनों को घोलें। बफर को रेफ्रिजरेटर में रखें जब तक कि तापमान 4 डिग्री सेल्सियस न हो जाए।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखते हुए घोल को 7.5 के पीएच में समायोजित करें।
    3. फैटी एसिड मुक्त बीएसए जोड़ें और मात्रा को 100% तक लाएं। घोल को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें। उपयोग तक इस घोल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बीएसए के बिना कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर तैयार करें जैसा कि तालिका 1 में देखा गया है।
    1. विआयनीकृत पानी में रसायनों को घोलें (~ 90% मात्रा)। बफर को रेफ्रिजरेटर में रखें जब तक कि तापमान 4 डिग्री सेल्सियस न हो जाए।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखते हुए घोल को 7.5 के पीएच में समायोजित करें।
    3. मात्रा को 100% तक लाएं। घोल को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें। उपयोग तक इस घोल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. तालिका 1 में देखे गए अनुसार कंकाल की मांसपेशी पुनर्निलंबन बफर तैयार करें।
    1. विआयनीकृत पानी में रसायनों को घोलें (~ 90% मात्रा)। बफर को रेफ्रिजरेटर में रखें जब तक कि तापमान 4 डिग्री सेल्सियस न हो जाए।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखते हुए घोल को 7.4 के पीएच में समायोजित करें।
    3. मात्रा को 100% तक लाएं। घोल को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें। उपयोग तक इस घोल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कंकाल की मांसपेशी श्वसन बफर तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में देखा गया है।
    1. फैटी एसिड मुक्त बीएसए को छोड़कर विआयनीकृत पानी (~ 90% मात्रा) में रसायनों को घोलें। बफर को तब तक गर्म करें जब तक कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस न हो जाए।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखते हुए समाधान को 7.0 के पीएच में समायोजित करें।
    3. फैटी एसिड मुक्त बीएसए जोड़ें और मात्रा को 100% तक लाएं। घोल को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें। उपयोग तक इस घोल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. श्वसन सब्सट्रेट तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में देखा गया है।
    1. सुनिश्चित करें कि इन सब्सट्रेट्स को 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 में डेटा संग्रह के दिन ताजा बनाया जाता है। उपयोग तक बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: प्रदान किए गए मान माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा लिए जाने वाले पर्याप्त सब्सट्रेट के लिए पर्याप्त रूप से केंद्रित समाधान बनाने के लिए हैं। सब्सट्रेट्स की अंतिम सांद्रता 2 एमएम पाइरूवेट, 2 एमएम मालेट, 10 एमएम ग्लूटामेट और 5 एमएम सक्सिनेट हैं।

2. माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का प्रदर्शन (चित्रा 2)।

नोट: माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप मोबाइल प्रयोगशाला के प्रयोगशाला बेंच क्षेत्र में किए जाते हैं, और सभी समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए।

  1. समतल जमीन पर मोबाइल प्रयोगशाला पार्क करें। जनरेटर चालू करें और वाहन को समतल करें। स्लाइड का विस्तार करें और उपकरण सेट करें।
  2. बफर की वांछित मात्रा को पिघलाएं।
    नोट: आम तौर पर, प्रति मांसपेशी बीएसए के बिना कंकाल की मांसपेशी अलगाव बफर के 30 एमएल और कंकाल की मांसपेशी अलगाव बफर के 10 एमएल की आवश्यकता होती है।
  3. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कक्षों को प्रयोगों के वांछित तापमान और निर्माता के निर्देशों के अनुसार वर्तमान बैरोमेट्रिक दबाव के लिए सेट और कैलिब्रेट करें। प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट कक्षों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  4. पशु को मौत के घाट उतार दें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में इच्छामृत्यु के लिए डिकैपिटेशन का उपयोग किया गया है। कुछ गैसें, जैसे कार्बन डाइऑक्साइड और आइसोफ्लुरेन, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन 18,19,20 को प्रभावित करती हैं; प्रत्येक अध्ययन के लिए इच्छामृत्यु की सर्वोत्तम विधि का चयन करते समय इन प्रभावों पर विचार किया जाना चाहिए। प्रत्येक अध्ययन के लिए कौन सी विधि का प्रदर्शन किया जाना चाहिए, यह पूछे जा रहे वैज्ञानिक प्रश्न द्वारा निर्धारित किया जाएगा।
  5. कंकाल की मांसपेशियों को उत्पाद ति करें, वसा और संयोजी ऊतक को जल्दी से हटा दें, वजन करें, और मांसपेशियों को बीएसए (कम से कम 1/10 डब्ल्यू / वी) (उदाहरण के लिए, कंकाल की मांसपेशी के 1 ग्राम से 10 एमएल बफर) के साथ कंकाल की मांसपेशी अलगाव बफर में रखें।
  6. कंकाल की मांसपेशियों को बर्फ पर कैंची से रगड़ें।
  7. कटे हुए 5 एमएल पाइप टिप का उपयोग करके कीमा ऊतक को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसे 5 सेकंड के लिए 50% शक्ति पर ब्लेड ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ समरूप करें। प्रोटीज (5 मिलीग्राम / ग्राम गीली मांसपेशी) जोड़ें और 7 मिनट के लिए पचाएं, हर 30 सेकंड में घोल को मिलाएं। बीएसए के साथ आइसोलेशन बफर की समान मात्रा जोड़कर प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
  8. 10 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें। एक कटे हुए 5 एमएल पाइप टिप का उपयोग करके डबल-लेयर्ड चीज़क्लॉथ के माध्यम से सुपरनैटेंट को एक साफ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। भूरे रंग के माइटोकॉन्ड्रियल गोली को अवक्षेपित करने के लिए 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. शेष सतह पर तैरने वाला डालें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बीएसए के साथ अलगाव बफर की समान मात्रा जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवारों से माइटोकॉन्ड्रियल गोली को धीरे से काम करके एक लचीले स्क्रैपर (पुलिसकर्मी) के साथ माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित करें। 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. शेष सतह पर तैरने वाला डालें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बीएसए के बिना अलगाव बफर की समान मात्रा जोड़ें। एक साफ पुलिसकर्मी के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवारों से माइटोकॉन्ड्रियल गोली को धीरे से काम करके माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित करें। 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  11. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और माइटोकॉन्ड्रियल गोली को एक साफ पुलिसकर्मी के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवारों से धीरे-धीरे काम करके माइटोकॉन्ड्रियल पेलेट को रिसस्पेंशन बफर में फिर से निलंबित करें।
    नोट: रिसस्पेंशन बफर की मात्रा माइटोकॉन्ड्रिया गोली के आकार पर निर्भर करेगी।
  12. पुन: निलंबित माइटोकॉन्ड्रिया को 1 एमएल पिपेट टिप के साथ एक डोंस होमोजिनाइज़र में स्थानांतरित करें। डोंस होमोजिनाइज़र का उपयोग करके, 4-5 पास के साथ निलंबन को सावधानीपूर्वक समरूप करें।
  13. माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को एक लेबल 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक और कट 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके रखें।

3. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप (चित्रा 3)।

  1. कॉम्प्लेक्स आई सब्सट्रेट्स;
    1. कक्ष में श्वसन बफर के 945 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि हलचल घूम रही है, और बफर तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है। डेटा संग्रह की रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें।
    2. ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिर होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया के 20 μL जोड़ें और कक्ष पर ढक्कन रखें। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि माइटोकॉन्ड्रिया को कक्ष में जोड़ा गया था।
    3. 1 एम ग्लूटामेट के 10 μL, 200 mM Malate के 10 μL, और 200 mM पाइरूवेट के 10 μL को अलग-अलग सिरिंज के साथ कक्ष में जोड़ें और सिग्नल स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि सब्सट्रेट जोड़े गए हैं।
      नोट: इन सब्सट्रेट्स का उपयोग आमतौर पर कार्बोहाइड्रेट संचालित श्वसन को मापने के लिए किया जाता है। वसा-संचालित श्वसन को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट्स के अन्य संयोजनों के लिए,21 देखें।
    4. एक अलग सिरिंज के साथ एडीपी के 5 μL जोड़ें और तेजी से ऑक्सीजन की खपत का निरीक्षण करें (राज्य 3)। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि एडीपी जोड़ा गया था।
      नोट: अतिरिक्त एडीपी के फॉस्फोराइलेशन के बाद, ऑक्सीजन की खपत दर राज्य 4 तक स्थिर हो जाएगी।
    5. राज्य 4 डेटा संग्रह के 4 मिनट के बाद, रिकॉर्डिंग समाप्त करें। डेटा फ़ाइल सहेजें.
  2. कॉम्प्लेक्स II सब्सट्रेट्स।
    1. कक्ष में श्वसन बफर के 963 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि हलचल घूम रही है, और बफर तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है। डेटा संग्रह की रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें।
    2. ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिर होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया के 20 μL जोड़ें और कक्ष पर ढक्कन रखें। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि माइटोकॉन्ड्रिया को समाधान में जोड़ा गया था।
    3. μL रोटेनोन के 2 μL जोड़ें, इसके बाद अलग-अलग सिरिंज का उपयोग करके कक्ष में 500 mM के 10 μL सक्सिनेट जोड़ें और सिग्नल स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि सब्सट्रेट जोड़े गए हैं।
    4. एक अलग सिरिंज का उपयोग करके एडीपी के 5 μL जोड़ें और तेजी से ऑक्सीजन की खपत का निरीक्षण करें (राज्य 3)। सॉफ्टवेयर में, निरूपित करें कि एडीपी जोड़ा गया था।
      नोट: अतिरिक्त एडीपी के फॉस्फोराइलेशन के बाद, ऑक्सीजन की खपत दर राज्य 4 तक स्थिर हो जाएगी।
    5. राज्य 4 डेटा संग्रह के 4 मिनट के बाद, रिकॉर्डिंग समाप्त करें। डेटा फ़ाइल सहेजें.

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Representative Results

वर्तमान पांडुलिपि ने एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला (चित्रा 1) में जंगली-व्युत्पन्न मस मस्कुलस (एन = 7, पुरुष = 5, महिला = 2; आयु = 1.30 ± 0.2 वर्ष) के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की जांच की। कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए, पूरे हिंदलिम्ब, इस प्रकार एरोबिक और एनारोबिक मांसपेशी, माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव (चित्रा 2) के लिए उपयोग किया गया था। कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन डेटा के उदाहरण चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। चित्रा 3 ए और चित्रा 3 बी जटिल आई-संचालित माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 3 ए में देखा गया तीव्र ढलान उच्च अधिकतम श्वसन दर का प्रतिनिधित्व करता है। यह आगे डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला मूल्य है। हिंदलिम्ब कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रिया का सफल अलगाव तेज मोड़ और एक नई ढलान के स्थिरीकरण द्वारा देखा जाता है, जो राज्य 4 (चित्रा 3 बी) को निर्धारित करता है।

इन आंकड़ों की व्याख्या माइटोकॉन्ड्रिया के उच्च कार्य करने के रूप में भी की जा सकती है क्योंकि राज्य 4 को स्थापित करने के लिए तेज मोड़ होता है। जटिल II-संचालित माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (चित्रा 3 सी और चित्रा 3 डी) के लिए एक समान पैटर्न देखा जा सकता है। चित्रा 3 ई, एफ खराब कार्यशील माइटोकॉन्ड्रिया का प्रदर्शन करता है, या तो माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी या असफल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के कारण। चित्रा 3 ई जटिल आई-संचालित माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के युग्मन को दर्शाता है, जैसा कि राज्य 4 की बारी से देखा जाता है। हालांकि, चित्रा 3 एफ अयुग्मित जटिल द्वितीय माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को दर्शाता है, जैसा कि एडीपी के अतिरिक्त एक सपाट रेखा द्वारा प्रदर्शित किया गया है, और राज्य 4 डेटा का उत्पादन करने के लिए कोई "मोड़" नहीं है। ये डेटा माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के दौरान संभावित समस्याओं का सुझाव देंगे, जिनकी चर्चा नीचे की गई है।

इन जानवरों के जटिल I और जटिल II दोनों के लिए राज्य 3, राज्य 4 और RCR के संख्यात्मक मान चित्र 4 में पाए जा सकते हैं। इन आंकड़ों को राज्य 3 (चित्रा 3 ए, सी) को निर्धारित करने के लिए एडीपी को जोड़ने के बाद सबसे तेज ढलान के 30 एस को मापकर और राज्य 4 (चित्रा 3 बी, डी) को मापने के लिए 1 मिनट के लिए "मोड़" के बाद ढलान को मापकर निर्धारित किया गया था। एक बार जब ये मान प्राप्त हो गए, तो डेटा को प्रोटीन सामग्री (ब्रैडफोर्ड परख22 के माध्यम से) के लिए सामान्यीकृत किया गया। सामान्यीकृत मानों का उपयोग करके, आरसीआर की गणना सामान्यीकृत राज्य 3 मान को सामान्यीकृत राज्य 4 मान से विभाजित करके की गई थी।

Figure 1
चित्र 1: एयू मिटोमोबाइल, एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला। (ए) एयू मिटोमोबाइल के बाहर। (बी) वाहन के अंदर सामने की ओर देखते हुए जहां कोई बदलाव नहीं किया गया था। (सी) वाहन का पिछला हिस्सा बेंच, भंडारण डिब्बे और सेंट्रीफ्यूज की किस्त दिखाता है। (डी) डेटा संग्रह के दौरान उपकरणों की स्थापना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव और श्वसन माप प्रक्रिया। (1) ऊतक को जानवर से विच्छेदित किया जाता है और बफर में रखा जाता है जहां इसे (2) कीमा, होमोजिनाइज्ड, प्रोटीज के साथ इलाज किया जाता है, और माइटोकॉन्ड्रियल गोली प्राप्त होने तक सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है। (3) माइटोकॉन्ड्रिया गोली को फिर से निलंबित किया जाता है, और श्वसन डेटा प्राप्त किया जाता है। (4) ऑक्सीजन खपत डेटा का उपयोग राज्य 3, राज्य 4 और आरसीआर की गणना करने के लिए किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: आरसीआर = श्वसन नियंत्रण अनुपात। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जटिल I और जटिल II सब्सट्रेट्स के साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप। जटिल आई सब्सट्रेट्स के साथ ऑक्सीजन की खपत, राज्य 3 (ए) और राज्य 4 (बी) के ढलान विश्लेषण को उजागर करती है। जटिल II सब्सट्रेट्स के साथ ऑक्सीजन की खपत, राज्य 3 (सी) और राज्य 4 (डी) के ढलान विश्लेषण को उजागर करती है। उप-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को जटिल I-संचालित श्वसन (E) और जटिल II-संचालित श्वसन (F) में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एयू मिटोमोबाइल में घर के चूहों (मस मस्कुलस) पर एकत्र किए गए डेटा। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव और श्वसन यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था। जटिल आई श्वसन दर निर्धारित करने के लिए पाइरूवेट, मैलेट और ग्लूटामेट का उपयोग किया गया था। जटिल द्वितीय श्वसन दर को मापने के लिए सक्सिनेट और रोटेनोन का उपयोग किया गया था। (ए) कॉम्प्लेक्स I राज्य 3 माप, (बी) कॉम्प्लेक्स I राज्य 4 माप, (C) कॉम्प्लेक्स I RCR, (D) कॉम्प्लेक्स II राज्य 3 माप, (E) कॉम्प्लेक्स II राज्य 4 माप, और (F) कॉम्प्लेक्स II RCR। संक्षिप्त नाम: आरसीआर = श्वसन नियंत्रण अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कंकाल की मांसपेशियों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) बीएसए, एकाग्रता (एमएम) बीएसए के बिना, एकाग्रता (एमएम)
KCl 100 100
ट्रिस-एचसीएल 40 40
ट्रिस-बेस 10 10
MgCl2 1 1
EGTA 1 1
एटीपी 0.2 0.2
फैटी एसिड मुक्त बीएसए 0.15% -
कंकाल की मांसपेशियों के लिए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया रीसस्पेंशन बफर।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता (mM)
मैनिटोल 220
शर्करा 70
ट्रिस-एचसीएल 10
EGTA 1

तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर (बीएसए के साथ और बिना) और कंकाल की मांसपेशियों के लिए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया रिसस्पेंशन बफर।

श्वसन बफर
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता (mM)
KCl 100
MOPS 50
KH2PO4 10
ग्लूकोज़ 20
MgCl2 10
EGTA 1
फैटी एसिड मुक्त बीएसए 0.20%
श्वसन सब्सट्रेट्स।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता (mM)
Pyruvate 200
मैलेट 200
Succinate 500
ADP 100
ग्लूटामेट 1000

तालिका 2: श्वसन बफर और सब्सट्रेट।

राज्य 3 राज्य 4 RCR पढ सब्सट्रेट्स
368.3±80.4 68.9±25.0 5.8±1.6 12 2 mM पाइरूवेट, 2 mM मैलेट
241.8±22.5 28.9±3.2 8.3±1.9 23 5 mM पाइरूवेट, 2 mM malate
285.7±36.5 81.9±2.9 3.5±1.0 23 10 mM सक्सिनेट, 4 μM rotenone
493.4±105.4 61.3±9.6 8.2±2.2 वर्तमान अध्ययन 2 mM पाइरूवेट, 2 mM Malate, 10 mM ग्लूटामेट
559.5±74.9 165.2±18.5 3.4±0.2 वर्तमान अध्ययन 5 mM सक्सिनेट, 4 μg/μL rotenone

तालिका 3: राज्य 3, राज्य 4 और आरसीआर के तुलनात्मक मूल्य। संक्षिप्त नाम: आरसीआर = श्वसन नियंत्रण अनुपात। राज्य 3 और राज्य 4 मान nmoles O2 / mg प्रोटीन / min में दिखाए गए हैं।

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Discussion

मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने और दूरस्थ क्षेत्र साइटों पर ऊतक संग्रह के 2 घंटे के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापने में सक्षम बनाती है। यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि एयू माइटोमोबाइल में किए गए माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के माप एक विश्वविद्यालय अनुसंधान प्रयोगशाला में किए गए माप के बराबर हैं। विशेष रूप से, यहां प्रस्तुत जंगली-व्युत्पन्न मस मस्कुलस के लिए राज्य 3, राज्य 4 और आरसीआर के मान उसी प्रयोगशाला और अन्य से पहले प्रकाशित परिणामों के साथ तुलनीय हैं (तालिका 3)12,23)। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिन्न चूहों के उपभेदों और तरीकों का उपयोग करने के कारण, इन अध्ययनों की सीधी तुलना नहीं की जा सकती है। ये परिणाम इस मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के माप के लिए अवधारणा का प्रमाण प्रदर्शित करते हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव और श्वसन के लिए आवश्यक सभी रसायनों और सामग्रियों को मोबाइल प्रयोगशाला के भीतर ले जाया और संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों को स्थापित करने और प्रदर्शन करते समय पहुंच में आसानी होती है। इसके अतिरिक्त, एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल प्रयोगशाला में एकत्र किए गए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्सर्जन जैसे अन्य जैव रासायनिक माप करने के लिए एक अनूठा नमूना प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, जमे हुए माइटोकॉन्ड्रिया को अतिरिक्त जैव रासायनिक माप (जैसे, व्यक्तिगत इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला एंजाइम गतिविधियों) के लिए एक स्थिर प्रयोगशाला में ले जाया जा सकता है। विशेष रूप से, सेंट्रीफ्यूजेशन भेदभाव के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने का एकमात्र तरीका नहीं है। अन्य प्रयोगशालाओं ने परमेबिलाइज्ड फाइबर के साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के सफल माप का प्रदर्शन किया है। यद्यपि वर्तमान पांडुलिपि इस विधि का वर्णन नहीं करती है (परमेबिलाइज्ड फाइबर के अधिक विवरण के लिए, 24,25,26,27,28 देखें), पाठकों के लिए यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी लैब इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री भी रख सकती है। कृपया इन विधियों में से प्रत्येक की ताकत और कमजोरियों पर अन्य समीक्षाएं देखें 25,29,30.

माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक अनुसंधान करने वाली कई प्रयोगशालाओं ने समस्या निवारण सिफारिशें प्रकाशित की हैं जो पाठकों को उपयोगी15,17 लग सकती हैं। किसी भी एकल प्रयोगात्मक परियोजना के लिए, सभी डेटा एकत्र करने के लिए बफर का एक बैच बनाया जाना चाहिए। अलग-अलग दिनों में किए गए बफर का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप को प्रभावित करने के लिए समाधान में भिन्नता का अवसर बनाता है। अलगाव प्रक्रिया के दौरान बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान होगा; हालांकि, प्रयोगशाला प्रशिक्षण के माध्यम से अलगाव विधि का उचित निष्पादन उस क्षति को कम कर सकता है जो स्वाभाविक रूप से इस प्रक्रियाके साथ होगा29,31। अलगाव प्रक्रिया के दौरान, गैर-कार्यात्मक या अत्यधिक क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को एक कॉम्पैक्ट भूरे रंग की गोली के बजाय एक सफेद फ्लफी माइटोकॉन्ड्रियल गोली द्वारा इंगित किया जाता है। नॉनफंक्शनल या क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया ब्लेड होमोजेनाइजेशन के दौरान अत्यधिक आरपीएम के कारण हो सकता है, बहुत लंबे समय तक होमोजेनाइजेशन, बहुत अधिक प्रोटीज जोड़ना या बहुत लंबे समय तक पचना, या माइटोकॉन्ड्रिया के अंतिम पुन: निलंबन के दौरान उपयोग किए जाने वाले बहुत सारे स्ट्रोक।

इसके अलावा, किस मांसपेशी को अलग करना है और कितनी मांसपेशियों का उपयोग किया जाता है, इसका विकल्प माइटोकॉन्ड्रियल उपज को प्रभावित करेगा। उदाहरण के लिए, एक उच्च माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व वाले जानवर में, जैसे कि पक्षी21, एक चूहे के हिंदलिम्ब से कंकाल की मांसपेशी फाइबर प्रकारों के मिश्रण की तुलना में अधिक माइटोकॉन्ड्रिया को अवक्षेपित किया जाएगा। यह सफल अलगाव के लिए आवश्यक ऊतक की मात्रा को भी बदल देगा। एक ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व जितना अधिक होगा, सफल अलगाव के लिए आवश्यक ऊतक की मात्रा उतनी ही कम होगी। शोधकर्ताओं को अंतिम पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में जोड़े गए मैनिटोल-सुक्रोज समाधान की मात्रा पर भी विचार करना चाहिए। एक अधिक घनी आबादी वाले माइटोकॉन्ड्रियल गोली को उच्च कमजोर पड़ने की आवश्यकता होगी, जबकि कम घनी आबादी वाले माइटोकॉन्ड्रियल गोली को कम कमजोर पड़ने की आवश्यकता होगी। कमजोर पड़ने की सीमा जानवर पर निर्भर करेगी, कंकाल की मांसपेशी की ऑक्सीडेटिव प्रकृति को अलग किया जा रहा है, और माइटोकॉन्ड्रियल गोली कितनी घनी है।

एक मोबाइल प्रयोगशाला में डेटा संग्रह के लिए आवश्यक सभी उपकरणों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त विद्युत शक्ति होना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। विशेष रूप से, प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज ऑपरेशन के दौरान एक उच्च प्रवाह खींचता है (विशेष रूप से कूलडाउन के प्रारंभिक चरणों के दौरान)। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष विचार किए जाने चाहिए कि वाहन का विद्युत उत्पादन एक साथ चलाने के लिए आवश्यक उपकरणों की विद्युत मांग से मेल खाता है। एक सिफारिश जो इस सीमा को हल कर सकती है वह अधिक बिजली स्रोतों (जैसे, अतिरिक्त बैटरी, अतिरिक्त जनरेटर) को जोड़ना है। विशेष रूप से, परमेबिलाइज्ड फाइबर के साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने की विधि को प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और यह सीमित शक्ति स्रोत को एक संकल्प भी प्रदान कर सकता है। मोबाइल प्रयोगशाला के उपयोग में पर्यावरणीय परिस्थितियों और सड़क की गुणवत्ता पर भी विचार किया जाना चाहिए। यहां चर्चा की गई मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला को स्पष्ट मौसम के साथ अंतरराज्यीय सड़कों पर सफलतापूर्वक संचालित किया गया था। कठोर मौसम के साथ गंदी सड़कें वाहन को रुचि के स्थान पर चलाने में अधिक कठिनाई पेश करेंगी। यद्यपि माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव एक नई विधि नहीं है, एक मोबाइल प्रयोगशाला में इसका उपयोग मुक्त-जीवित जानवरों में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान को मापने का एक अनूठा तरीका प्रदान करता है। यह प्रयोगशाला और जंगली जानवरों 32,33,34 के बीच अंतर को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला शोधकर्ताओं को प्राकृतिक दुनिया में जानवरों के बीच पाए जाने वाले ऊर्जावान बाधाओं और ऊर्जावान चरम सीमाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने एयू मिटोमोबाइल के संरचनात्मक और विद्युत आउटफिटिंग में मदद करने के लिए ऑबर्न विश्वविद्यालय में सैमुअल गिन कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग के इलेक्ट्रिकल और कंप्यूटर इंजीनियरिंग विभाग से मार्क नेल्म्स और जॉन टेनेंट को स्वीकार किया। इसके अतिरिक्त, लेखक एयू मिटोमोबाइल को तैयार करने और अंतःविषय अनुसंधान (पेयर) अनुदान के लिए ऑबर्न यूनिवर्सिटी प्रेसिडेंशियल अवार्ड्स से शोध के लिए धन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL centrifuge tubes VWR 87003-294
2.0 mL centrifuge tubes VWR 87003-298
50 mL centrifuge tubes VWR 21009-681 Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP VWR 97061-104
ATP VWR 700009-070
Bradford VWR 7065-020
Clear 96 well plate VWR 82050-760 Greiner Bio-One
Dounce homogenizer VWR 22877-284 Corning
EGTA VWR EM-4100
Filter paper Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA VWR 89423-672
Glucose VWR BDH8005-500G
Glutamate VWR A12919
Hamilton Syringes VWR 60373-985 Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph Hansatech Instruments Ltd No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4 VWR 97062-350
Malate VWR 97062-140
Mannitol VWR 97061-052
Membrane Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2 VWR 97063-152
MOPS VWR 80503-004
Policeman VWR 470104-462
Polytron Thomas Scientific 11090044
Potassium chloride (KCl) VWR 97061-566
Protease VWR 97062-366 Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid VWR 97061-448
Sodium Dithionite VWR AA33381-22
Succinate VWR 89230-086
Sucrose VWR BDH0308-500G
Tris-Base VWR 97061-794
Tris-HCl VWR 97061-258

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References

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