Im lebenden Organismus Drahtlose optogenetische Steuerung des motorischen Verhaltens
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie drahtlose Optogenetik in Kombination mit Hochgeschwindigkeits-Videografie in einer einzigen Pellet-Reach-to-Grasp-Aufgabe verwendet werden kann, um die neuronalen Schaltkreise zu charakterisieren, die an der Leistung eines qualifizierten motorischen Verhaltens in sich frei bewegenden Mäusen beteiligt sind.
Abstract
Feinmotorik ist im Alltag essentiell und kann bei mehreren Erkrankungen des Nervensystems beeinträchtigt werden. Die Erfassung und Durchführung dieser Aufgaben erfordert eine sensorisch-motorische Integration und beinhaltet eine präzise Steuerung bilateraler Gehirnschaltkreise. Die Implementierung unimanueller Verhaltensparadigmen in Tiermodellen wird das Verständnis des Beitrags von Gehirnstrukturen, wie dem Striatum, zum komplexen motorischen Verhalten verbessern, da es die Manipulation und Aufzeichnung der neuronalen Aktivität bestimmter Kerne unter Kontrollbedingungen und Krankheiten während der Ausführung der Aufgabe ermöglicht.
Seit ihrer Entstehung ist die Optogenetik ein dominantes Werkzeug für die Befragung des Gehirns, indem sie eine selektive und gezielte Aktivierung oder Hemmung neuronaler Populationen ermöglicht. Die Kombination von Optogenetik mit Verhaltensassays beleuchtet die zugrunde liegenden Mechanismen spezifischer Gehirnfunktionen. Drahtlose Head-Mounted-Systeme mit miniaturisierten Leuchtdioden (LEDs) ermöglichen die optogenetische Fernsteuerung in einem völlig frei beweglichen Tier. Dadurch wird vermieden, dass die Einschränkungen eines kabelgebundenen Systems für das Verhalten von Tieren weniger einschränkend sind, ohne die Lichtemissionseffizienz zu beeinträchtigen. Das aktuelle Protokoll kombiniert einen drahtlosen optogenetischen Ansatz mit Hochgeschwindigkeits-Videografie in einer unimanuellen Geschicklichkeitsaufgabe, um den Beitrag spezifischer neuronaler Populationen zum feinmotorischen Verhalten zu analysieren.
Introduction
Motorisches geschicktes Verhalten ist bei den meisten von uns ausgeführten Bewegungen vorhanden, und es ist bekannt, dass es bei mehreren Gehirnstörungen beeinflusst wird 1,2,3,4,5,6. Die Durchführung von Aufgaben, die es ermöglichen, die Entwicklung, das Lernen und die Leistung qualifizierter Bewegungen zu untersuchen, ist entscheidend für das Verständnis der neurobiologischen Grundlagen der motorischen Funktion, insbesondere in Modellen von Hirnverletzungen, neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen 2,7,8,9,10,11,12,13 . Das Greifen nach und das Abrufen von Objekten erfolgt routinemäßig in alltäglichen Handlungen und ist eine der ersten motorischen Fähigkeiten, die während der frühen Entwicklung erworben und dann im Laufe der Jahre 5,6 verfeinert wurden. Es umfasst ein komplexes Verhalten, das sensorisch-motorische Prozesse wie die Wahrnehmung der Objektmerkmale, Bewegungsplanung, Aktionsauswahl, Bewegungsausführung, Körperkoordination und Geschwindigkeitsmodulation 7,14,15,16 erfordert. Daher erfordern unimanuelle Aufgaben mit hoher Geschicklichkeit die Teilnahme vieler Gehirnstrukturen beider Hemisphären 16,17,18,19,20,21,22. Bei Mäusen ist die Einzelpellet-Reach-to-Grasp-Aufgabe für mehrere Phasen charakterisiert, die separat gesteuert und analysiert werden können 7,13,23. Diese Funktion ermöglicht es, den Beitrag spezifischer neuronaler Subpopulationen in verschiedenen Stadien der Akquisition und Verhaltensleistung zu untersuchen und bietet eine Plattform für detaillierte Studien motorischer Systeme 13,23,24. Die Bewegung erfolgt in ein paar Sekunden; Daher sollte die Hochgeschwindigkeits-Videografie für die kinematische Analyse in verschiedenen Stufen der qualifizierten motorischen Trajektorie 7,25 verwendet werden. Aus den Videos können mehrere Parameter extrahiert werden, darunter Körperhaltung, Flugbahn, Geschwindigkeit und Art der Fehler25. Die kinematische Analyse kann verwendet werden, um subtile Veränderungen während der drahtlosen optogenetischen Manipulationzu erkennen 7,23.
Die Verwendung miniaturisierter Leuchtdioden (LEDs) zur Lichtabgabe über ein drahtloses Head-Mounted-System ermöglicht eine optogenetische Fernsteuerung, während das Tier die Aufgabe ausführt. Der drahtlose optogenetische Controller akzeptiert Einzelimpuls- oder kontinuierliche Triggerbefehle von einem Stimulator und sendet Infrarotsignale (IR) an einen Empfänger, der an die miniaturisierte LED23,26 angeschlossen ist. Das aktuelle Protokoll kombiniert diesen drahtlosen optogenetischen Ansatz mit der Hochgeschwindigkeits-Videografie einer Geschicklichkeitsaufgabe, um die Rolle spezifischer neuronaler Populationen während der Durchführung des feinmotorischen Verhaltenszu analysieren 23. Da es sich um eine unimanuelle Aufgabe handelt, ermöglicht es die Bewertung der Beteiligung von Strukturen in beiden Hemisphären. Traditionell steuert das Gehirn die Körperbewegung auf sehr asymmetrische Weise; Aufgaben mit hoher Geschicklichkeit erfordern jedoch eine sorgfältige Koordination und Kontrolle von vielen Gehirnstrukturen, einschließlich ipsilateraler Kerne und differentieller Beiträge neuronaler Subpopulationen innerhalb der Kerne 10,20,21,22,23. Dieses Protokoll zeigt, dass subkortikale Strukturen aus beiden Hemisphären die Flugbahn des Vordergliedssteuern 23. Dieses Paradigma kann geeignet sein, andere Gehirnregionen und Modelle von Hirnerkrankungen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung der optogenetischen Manipulation neuronaler Populationen in klar definierten Verhaltensparadigmen erweitert unser Wissen über die Mechanismen, die der motorischen Kontrolle zugrunde liegen 7,23. Drahtlose Methoden eignen sich besonders für Aufgaben, die Tests an mehreren Tieren oder freie Bewegung erfordern34,35. Da jedoch Techniken und Geräte verfeinert werden, sollte es die erste Wahl …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das UNAM-PAPIIT-Projekt IA203520 unterstützt. Wir danken der IFC-Tieranlage für ihre Hilfe bei der Wartung von Mauskolonien und der Recheneinheit für die IT-Unterstützung, insbesondere Francisco Perez-Eugenio.
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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