In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato
Summary
Il presente protocollo descrive come utilizzare l’optogenetica wireless combinata con la videografia ad alta velocità in un singolo compito di reach-to-grasp del pellet per caratterizzare i circuiti neurali coinvolti nell’esecuzione del comportamento motorio qualificato nei topi che si muovono liberamente.
Abstract
Le capacità motorie sono essenziali nella vita di tutti i giorni e possono essere compromesse in diversi disturbi del sistema nervoso. L’acquisizione e l’esecuzione di questi compiti richiedono l’integrazione senso-motoria e comportano un controllo preciso dei circuiti cerebrali bilaterali. L’implementazione di paradigmi comportamentali unimanuali in modelli animali migliorerà la comprensione del contributo delle strutture cerebrali, come lo striato, al comportamento motorio complesso in quanto consente la manipolazione e la registrazione dell’attività neurale di nuclei specifici in condizioni di controllo e malattia durante l’esecuzione del compito.
Fin dalla sua creazione, l’optogenetica è stata uno strumento dominante per interrogare il cervello consentendo l’attivazione o l’inibizione selettiva e mirata delle popolazioni neuronali. La combinazione di optogenetica con saggi comportamentali fa luce sui meccanismi alla base di specifiche funzioni cerebrali. I sistemi wireless montati sulla testa con diodi a emissione di luce miniaturizzati (LED) consentono il controllo optogenetico remoto in un animale completamente libero. Ciò evita che le limitazioni di un sistema cablato siano meno restrittive per il comportamento degli animali senza compromettere l’efficienza dell’emissione luminosa. L’attuale protocollo combina un approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità in un compito di destrezza unimanuale per sezionare il contributo di specifiche popolazioni neuronali al comportamento motorio fine.
Introduction
Il comportamento motorio qualificato è presente durante la maggior parte dei movimenti eseguiti da noi ed è noto per essere influenzato in diversi disturbi cerebrali 1,2,3,4,5,6. L’implementazione di compiti che consentano di studiare lo sviluppo, l’apprendimento e le prestazioni di movimenti qualificati è fondamentale per comprendere le basi neurobiologiche della funzione motoria, specialmente nei modelli di lesioni cerebrali, disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico 2,7,8,9,10,11,12,13 . Raggiungere e recuperare oggetti viene fatto di routine nelle azioni della vita di tutti i giorni, ed è una delle prime abilità motorie acquisite durante lo sviluppo precoce e poi perfezionate negli anni 5,6. Comprende un comportamento complesso che richiede processi senso-motori come la percezione delle caratteristiche dell’oggetto, la pianificazione del movimento, la selezione dell’azione, l’esecuzione del movimento, la coordinazione del corpo e la modulazione della velocità 7,14,15,16. Pertanto, i compiti unimanuali ad alta destrezza richiedono la partecipazione di molte strutture cerebrali di entrambi gli emisferi 16,17,18,19,20,21,22. Nei topi, il singolo compito di reach-to-grasp del pellet è caratterizzato per diverse fasi che possono essere controllate e analizzate separatamente 7,13,23. Questa caratteristica permette di studiare il contributo di specifiche sottopopolazioni neuronali a diversi stadi di acquisizione e prestazioni comportamentali e fornisce una piattaforma per studi dettagliati dei sistemi motori 13,23,24. Il movimento avviene in un paio di secondi; pertanto, la videografia ad alta velocità dovrebbe essere utilizzata per l’analisi cinematica in fasi distinte della traiettoria motoria qualificata 7,25. Diversi parametri possono essere estratti dai video, tra cui la postura del corpo, la traiettoria, la velocità e il tipo di errori25. L’analisi cinematica può essere utilizzata per rilevare sottili cambiamenti durante la manipolazione optogenetica wireless 7,23.
L’utilizzo di diodi miniaturizzati a emissione di luce (LED) per fornire luce tramite un sistema wireless montato sulla testa consente di avere un controllo optogenetico remoto mentre l’animale esegue il compito. Il controller optogenetico wireless accetta comandi di trigger a impulso singolo o continuo da uno stimolatore e invia segnali a infrarossi (IR) a un ricevitore collegato al LED miniaturizzato23,26. L’attuale protocollo combina questo approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità di un compito di destrezza per sezionare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali durante l’esecuzione del comportamento motorio fine23. Poiché si tratta di un compito unimanuale, consente di valutare la partecipazione delle strutture in entrambi gli emisferi. Tradizionalmente, il cervello controlla il movimento del corpo in modo altamente asimmetrico; tuttavia, i compiti ad alta destrezza richiedono un’attenta coordinazione e controllo da parte di molte strutture cerebrali, compresi i nuclei ipsilaterali e il contributo differenziale delle sottopopolazioni neuronali all’interno dei nuclei 10,20,21,22,23. Questo protocollo mostra che le strutture sottocorticali di entrambi gli emisferi controllano la traiettoria dell’artoanteriore 23. Questo paradigma può essere adatto per studiare altre regioni del cervello e modelli di malattie cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso della manipolazione optogenetica delle popolazioni neuronali in paradigmi comportamentali ben definiti sta facendo progredire le nostre conoscenze sui meccanismi alla base del controllo motorio 7,23. I metodi wireless sono particolarmente adatti per compiti che richiedono test su più animali o la libera circolazione34,35. Tuttavia, poiché le tecniche e i dispositivi sono perfezionati, dovrebbe ess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto UNAM-PAPIIT IA203520. Ringraziamo la struttura per animali IFC per il loro aiuto nella manutenzione delle colonie di topi e l’unità computazionale per il supporto IT, in particolare a Francisco Perez-Eugenio.
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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