In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש באופטוגנטיקה אלחוטית בשילוב עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת הושטת יד לתפיסה של כדור יחיד כדי לאפיין את המעגלים העצביים המעורבים בביצוע ההתנהגות המוטורית המיומנת בעכברים הנעים בחופשיות.
Abstract
מיומנויות מוטוריות עדינות חיוניות בחיי היומיום ועלולות להיפגע במספר הפרעות במערכת העצבים. הרכישה והביצוע של משימות אלה דורשות אינטגרציה חושית-מוטורית וכרוכות בשליטה מדויקת על מעגלי המוח הדו-צדדיים. יישום פרדיגמות התנהגותיות חד-ממדיות במודלים של בעלי חיים ישפר את הבנת התרומה של מבני מוח, כמו הסטריאטום, להתנהגות מוטורית מורכבת מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ורישום של פעילות עצבית של גרעינים ספציפיים בתנאי בקרה ומחלות במהלך ביצוע המשימה.
מאז הקמתה, אופטוגנטיקה הייתה כלי דומיננטי לחקירת המוח על ידי כך שהיא מאפשרת הפעלה או עיכוב סלקטיביים וממוקדים של אוכלוסיות נוירונים. השילוב של אופטוגנטיקה עם מבחנים התנהגותיים שופך אור על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי מוח ספציפיים. מערכות אלחוטיות המותקנות על הראש עם דיודות פולטות אור ממוזערות (LED) מאפשרות שליטה אופטוגנטית מרחוק בחיה הנעה בחופשיות לחלוטין. זה מונע את המגבלות של מערכת קווית להיות פחות מגבילה להתנהגות של בעלי חיים מבלי להתפשר על יעילות פליטת האור. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישה של אופטוגנטיקה אלחוטית עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת מיומנות חד-ממדית כדי לנתח את התרומה של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות להתנהגות מוטורית עדינה.
Introduction
התנהגות מוטורית מיומנת קיימת במהלך רוב התנועות המבוצעות על ידינו, וידוע שהיא מושפעת ממספר הפרעות מוחיות 1,2,3,4,5,6. יישום מטלות המאפשרות לימוד ההתפתחות, הלמידה והביצועים של תנועות מיומנות הוא חיוני להבנת היסודות הנוירוביולוגיים של התפקוד המוטורי, במיוחד במודלים של פגיעה מוחית, הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירו-התפתחותיות 2,7,8,9,10,11,12,13 . הושטת יד ושליפת חפצים נעשית באופן שגרתי בפעולות בחיי היומיום, וזו אחת המיומנויות המוטוריות הראשונות שנרכשו במהלך ההתפתחות המוקדמת ולאחר מכן זוקקו במהלך השנים 5,6. הוא כולל התנהגות מורכבת הדורשת תהליכים חושיים-מוטוריים כגון תפיסת תכונות האובייקט, תכנון תנועה, בחירת פעולה, ביצוע תנועה, תיאום גוף וויסון מהירות 7,14,15,16. לפיכך, משימות חד-ממדיות של מיומנות גבוהה דורשות השתתפות של מבנים מוחיים רבים של שתי ההמיספרות 16,17,18,19,20,21,22. בעכברים, משימת ההגעה לתפיסת הכדורית הבודדת מאופיינת עבור מספר שלבים שניתן לשלוט בהם ולנתח אותם בנפרד 7,13,23. תכונה זו מאפשרת לחקור את התרומה של תת-אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בשלבים שונים של ביצועי רכישה והתנהגות ומספקת פלטפורמה למחקרים מפורטים של מערכות מוטוריות 13,23,24. התנועה מתרחשת תוך מספר שניות; לפיכך, יש להשתמש בצילום וידאו במהירות גבוהה לניתוח קינמטי בשלבים נפרדים של המסלול המוטורי המיומן 7,25. ניתן לחלץ מספר פרמטרים מהסרטונים, כולל תנוחת הגוף, מסלול, מהירות וסוג השגיאות25. ניתן להשתמש בניתוח קינמטי כדי לזהות שינויים עדינים במהלך מניפולציה אופטוגנטית אלחוטית 7,23.
שימוש בדיודות פולטות אור ממוזערות (LED) להעברת אור באמצעות מערכת אלחוטית המותקנת על הראש מאפשר שליטה אופטוגנטית מרחוק בזמן שהחיה מבצעת את המשימה. הבקר האופטוגנטי האלחוטי מקבל פקודות טריגר בפולס יחיד או רציף ממריץ ושולח אותות אינפרא אדום (IR) למקלט המחובר ל-LED23,26 הממוזער. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישה זו של אופטוגנטיקה אלחוטית עם צילום וידאו במהירות גבוהה של משימת מיומנות כדי לנתח את התפקיד של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות במהלך הביצועים של התנהגות מוטורית עדינה23. מכיוון שמדובר במשימה חד-ממדית, היא מאפשרת להעריך את השתתפותם של מבנים בשתי ההמיספרות. באופן מסורתי, המוח שולט בתנועת הגוף באופן אסימטרי מאוד; עם זאת, משימות מיומנות גבוהה דורשות תיאום ושליטה קפדניים ממבנים מוחיים רבים, כולל גרעינים איפסילטרליים ותרומה דיפרנציאלית של תת-אוכלוסיות עצביות בתוך גרעינים 10,20,21,22,23. פרוטוקול זה מראה כי מבנים תת-קורטיקליים משתי ההמיספרות שולטים במסלול של הפורלימב23. פרדיגמה זו יכולה להתאים לחקר אזורים אחרים במוח ומודלים של מחלות מוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש במניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות נוירונים בפרדיגמות התנהגותיות מוגדרות היטב מקדם את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הבקרה המוטורית 7,23. שיטות אלחוטיות מתאימות במיוחד למשימות הדורשות ניסויים על מספר בעלי חיים או תנועה חופשית34,35<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט UNAM-PAPIIT IA203520. אנו מודים למתקן בעלי החיים של IFC על עזרתם בתחזוקת מושבות עכברים וביחידה החישובית לתמיכת IT, במיוחד לפרנסיסקו פרז-יוג’ניו.
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
References
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
- MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
- Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
- Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
- Sacrey, L. A. -. O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
- Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), 7148-7158 (1994).
- Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
- Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
- Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
- Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
- Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
- d’Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
- Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
- Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
- Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
- Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
- Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
- Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
- Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
- Overduin, S. A., d’Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
- Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
- Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
- Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
- Packer, A. M., et al. . Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).
