הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש באופטוגנטיקה אלחוטית בשילוב עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת הושטת יד לתפיסה של כדור יחיד כדי לאפיין את המעגלים העצביים המעורבים בביצוע ההתנהגות המוטורית המיומנת בעכברים הנעים בחופשיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיומנויות מוטוריות עדינות חיוניות בחיי היומיום ועלולות להיפגע במספר הפרעות במערכת העצבים. הרכישה והביצוע של משימות אלה דורשות אינטגרציה חושית-מוטורית וכרוכות בשליטה מדויקת על מעגלי המוח הדו-צדדיים. יישום פרדיגמות התנהגותיות חד-ממדיות במודלים של בעלי חיים ישפר את הבנת התרומה של מבני מוח, כמו הסטריאטום, להתנהגות מוטורית מורכבת מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ורישום של פעילות עצבית של גרעינים ספציפיים בתנאי בקרה ומחלות במהלך ביצוע המשימה.
מאז הקמתה, אופטוגנטיקה הייתה כלי דומיננטי לחקירת המוח על ידי כך שהיא מאפשרת הפעלה או עיכוב סלקטיביים וממוקדים של אוכלוסיות נוירונים. השילוב של אופטוגנטיקה עם מבחנים התנהגותיים שופך אור על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי מוח ספציפיים. מערכות אלחוטיות המותקנות על הראש עם דיודות פולטות אור ממוזערות (LED) מאפשרות שליטה אופטוגנטית מרחוק בחיה הנעה בחופשיות לחלוטין. זה מונע את המגבלות של מערכת קווית להיות פחות מגבילה להתנהגות של בעלי חיים מבלי להתפשר על יעילות פליטת האור. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישה של אופטוגנטיקה אלחוטית עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת מיומנות חד-ממדית כדי לנתח את התרומה של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות להתנהגות מוטורית עדינה.
מבוא
התנהגות מוטורית מיומנת קיימת במהלך רוב התנועות המבוצעות על ידינו, וידוע שהיא מושפעת ממספר הפרעות מוחיות 1,2,3,4,5,6. יישום מטלות המאפשרות לימוד ההתפתחות, הלמידה והביצועים של תנועות מיומנות הוא חיוני להבנת היסודות הנוירוביולוגיים של התפקוד המוטורי, במיוחד במודלים של פגיעה מוחית, הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירו-התפתחותיות 2,7,8,9,10,11,12,13 <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מקומיות ולאומיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול IACUC של המכון לפיזיולוגיה תאית IACUC VLH151-19). Drd1-Cre עכברים זכרים מהונדסים27, 35-40 יום לאחר הלידה עם רקע C57BL/6 שימשו בפרוטוקול הנוכחי. עכברים הוחזקו בתנאים הבאים: טמפרטורה 22±1 מעלות צלזיוס; לחות 55%; לוח זמנים אור 12/12 שעות עם אורות כבויים בשעה 19:00 ונגמלו ביום שלאחר הלידה 21. גורים נגמלים שוכנו בקבוצות חד-מיניות של 2-5. בעלי חיים שוכנו בדיור סטטי עם צמרות מיקרו-מחסום. המצעים כללו שבבי אספן סטריליים. כדורי מכרסמים ומים מטוהרים ב-RO סופקו עד ליביטום, למעט כאשר צוין אחרת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטלת Reach-to-grasp היא פרדיגמה המשמשת באופן נרחב לחקר עיצוב, למידה, ביצועים וקינמטיקה של תנועת מיומנות עדינה תחת מניפולציות ניסיוניות שונות. עכברים לומדים לבצע את המשימה תוך מספר ימים ולהשיג דיוק של יותר מ-55% ולהגיע למישור לאחר 5 ימי אימון (איור 2A,B). בדומה למה שדווח בעבר, אחוז מבעלי החיים אינם מבצעים את המשימה כראוי (29.62%), ויש לכלול אותם מניתוח נוסף30. אלה כוללים תת-קבוצה של עכברים שאינם לומדים (6/54 עכברים, 11.1%) שמתחילת האימון מפספסים את המט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש במניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות נוירונים בפרדיגמות התנהגותיות מוגדרות היטב מקדם את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הבקרה המוטורית 7,23. שיטות אלחוטיות מתאימות במיוחד למשימות הדורשות ניסויים על מספר בעלי חיים או תנועה חופשית34,35. עם זאת, ככל שהטכניקות והמכשירים משתכללים, זו צריכה להיות האפשרות המועדפת על כל משימה התנהגותית בשילוב עם אופטוגנטיקה34,36
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין גילויים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט UNAM-PAPIIT IA203520. אנו מודים למתקן בעלי החיים של IFC על עזרתם בתחזוקת מושבות עכברים וביחידה החישובית לתמיכת IT, במיוחד לפרנסיסקו פרז-יוג'ניו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכונת הרדמה | RWD | R583S | וופורייזר איזופלורן |
| אנסקט | PiSA | קטמין | |
| לוח לחם | Thorlabs | MB3090/M | לחם אופטי אלומיניום מוצק |
| עדשת מצלמה | Canon | 50mmf / 1.4 עדשות פוקוס ידני (c-mount) | |
| מערכת מצלמה | BrainVision | MiCAM02 | בקר מצלמה ו סנכרון |
| צמר גפן תמיסת | |||
| CS תמיסת | נתרן כלורי PiSA | ||
| תא אימון מותאם אישית | ביתית | ||
| #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | חותך חריטה |
| כדורי שוקולד ללא אבק | Bio-Serv | F05301 | |
| אלכוהול אתילי | J. T. Baker | 9000-02 | אתנול |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears מחומר PVA סופג |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | נימי זכוכית איזופלורן |
| Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | פיפטות עבור NanoJect II | |
| הידרוגן מי חמצן | Farmacom | אנטיספטי | |
| מצלמה במהירות גבוהה | BrainVision | MiCAM02-CMOS | מונוכרום מצלמות מהירות |
| אינפרא אדום | פולט טלאופטו | ||
| מזרק | |||
| LED צינורית | טלאופטו | TelC-C-L-D | צינורית LED 250um 487nm אור |
| Micropipette 10 | uL Eppendorf | Z740436 | |
| חולץ מיקרו-פיפטה | Sutter | P-87 | חולץ אופקי |
| מיקרוסקופ LSM780 | Zeiss | מיקרוסקופ קונפוקלי | |
| מיקרוטום | |||
| מקלט מדומה | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | מיקרו מזרק |
| מיכל חמצן | אינפרא אדום | ||
| (H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | וקטור ויראלי לביטוי ChR-2 |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| מאגר מלח פוספט | Sigma | P-4417 | טבליות חיץ מלח פוספט |
| קצות פיפטה 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL נפח |
| Pisabental | PiSA | נתרן pentobarbital | |
| פרספקס | מסחרי | אקריליק גיליון | |
| Povidone יוד | Farmacom | אנטיספטי | |
| פרוצ'ין | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | חומר סיכה לעיניים 15% שמן מינרלי/85% וזלין |
| כלי סיבובי | Kmoon | מיני מטחנה | סטנדרטי |
| אזמל | |||
| להב | |||
| מכשיר סטריאוטקסי | Stoelting | 51730D | מכשיר דיגיטלי |
| סופר-בונד C& B | שמש רפואי | שיניים צמנט | |
| כירורגי חד פעמי כובע | |||
| טלאופטו שלט רחוק Teleopto | |||
| Tg Drd1-Cre קו עכבר | Gensat | 036916-UCD | החדרת טרנסגן FK150Gsat |
| דבק רקמות | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 פלוס | Peico | ||
| מדיית הרכבה Microtome Vectashield עם מעבדות DAPI | וקטור | H-1200 | מדיית הרכבה |
| מקלט אלחוטי | Teleopto | TELER-1-P |
מקורות
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
