In vivo Controle Optogenético Sem Fio do Comportamento Motor Qualificado
Summary
O presente protocolo descreve como usar optogenética sem fio combinada com videografia de alta velocidade em uma única tarefa de alcance à compreensão de pelotas para caracterizar os circuitos neurais envolvidos no desempenho do comportamento motor qualificado em camundongos em movimento livre.
Abstract
Habilidades motoras finas são essenciais na vida cotidiana e podem ser comprometidas em vários distúrbios do sistema nervoso. A aquisição e o desempenho dessas tarefas requerem integração sensorial-motor e envolvem controle preciso dos circuitos cerebrais bilaterais. A implementação de paradigmas comportamentais unimanuais em modelos animais melhorará a compreensão da contribuição das estruturas cerebrais, como o estriado, para o comportamento motor complexo, pois permite a manipulação e o registro da atividade neural de núcleos específicos em condições de controle e doença durante o desempenho da tarefa.
Desde sua criação, a optogenética tem sido uma ferramenta dominante para interrogar o cérebro, permitindo ativação seletiva e direcionada ou inibição de populações neuronais. A combinação de optogenética com ensaios comportamentais lança luz sobre os mecanismos subjacentes de funções cerebrais específicas. Sistemas sem fio montados na cabeça com diodos miniaturizados emissores de luz (LEDs) permitem controle optogenético remoto em um animal totalmente em movimento livre. Isso evita que as limitações de um sistema com fio sejam menos restritivas para o comportamento dos animais sem comprometer a eficiência das emissões leves. O protocolo atual combina uma abordagem optogenética sem fio com videografia de alta velocidade em uma tarefa de destreza unimanual para dissecar a contribuição de populações neuronais específicas para o comportamento motor fino.
Introduction
O comportamento motor qualificado está presente durante a maioria dos movimentos realizados por nós, e é conhecido por ser afetado em vários distúrbios cerebrais 1,2,3,4,5,6. Implementar tarefas que permitam estudar o desenvolvimento, a aprendizagem e o desempenho de movimentos qualificados é crucial para entender os fundamentos neurobiológicos da função motora, especialmente em modelos de lesões cerebrais, distúrbios neurodegenerativas e neurodesenvolvimentos 2,7,8,9,10,11,12,13 . Alcançar e recuperar objetos é feito rotineiramente em ações da vida cotidiana, e é uma das primeiras habilidades motoras adquiridas durante o desenvolvimento precoce e depois refinadas ao longo dos anos 5,6. Compreende um comportamento complexo que requer processos sensoriais-motores, como a percepção das características do objeto, planejamento de movimento, seleção de ação, execução de movimento, coordenação corporal e modulação de velocidade 7,14,15,16. Assim, tarefas unimanuais de alta destreza requerem a participação de muitas estruturas cerebrais de ambos os hemisférios 16,17,18,19,20,21,22. Em camundongos, a única tarefa de alcance à compreensão de pelotas é caracterizada para várias fases que podem ser controladas e analisadas separadamente 7,13,23. Esse recurso permite estudar a contribuição de subpopulações neuronais específicas em diferentes estágios de aquisição e desempenho comportamental e fornece uma plataforma para estudos detalhados de sistemas motores 13,23,24. O movimento ocorre em alguns segundos; assim, a videografia de alta velocidade deve ser utilizada para análise cinemática em estágios distintos da trajetória motora qualificada 7,25. Vários parâmetros podem ser extraídos dos vídeos, incluindo postura corporal, trajetória, velocidade e tipo de erros25. A análise cinemática pode ser usada para detectar alterações sutis durante a manipulação optogenética sem fio 7,23.
O uso de diodos miniaturizados emissores de luz (LEDs) para fornecer luz através de um sistema sem fio montado na cabeça torna possível ter controle optogenético remoto enquanto o animal executa a tarefa. O controlador optogenético sem fio aceita comandos de gatilho de pulso único ou contínuo de um estimulador e envia sinais infravermelhos (IR) para um receptor conectado ao LED miniaturizado23,26. O protocolo atual combina essa abordagem optogenética sem fio com a videografia de alta velocidade de uma tarefa de destreza para dissecar o papel de populações neuronais específicas durante o desempenho do bom comportamento motor23. Por ser uma tarefa unimanual, permite avaliar a participação de estruturas em ambos os hemisférios. Tradicionalmente, o cérebro controla o movimento corporal de forma altamente assimétrica; no entanto, tarefas de alta destreza requerem coordenação e controle cuidadosos de muitas estruturas cerebrais, incluindo núcleos ipsilaterais e contribuição diferencial de subpopulações neuronais dentro dos núcleos 10,20,21,22,23. Este protocolo mostra que estruturas subcorticais de ambos os hemisférios controlam a trajetória do membro23. Esse paradigma pode ser adequado para estudar outras regiões cerebrais e modelos de doenças cerebrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso da manipulação optogenética de populações neuronais em paradigmas comportamentais bem definidos está avançando nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes ao controle motor 7,23. Métodos sem fio são especialmente adequados para tarefas que requerem testes em vários animais ou livre circulação34,35. No entanto, como as técnicas e dispositivos são refinados, deve ser a opção de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo projeto UNAM-PAPIIT IA203520. Agradecemos à instalação de animais ifc por sua ajuda com a manutenção de colônias de ratos e a unidade computacional para suporte de TI, especialmente a Francisco Perez-Eugenio.
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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