In vivo Control optogenético inalámbrico del comportamiento motor calificado
Summary
El presente protocolo describe cómo utilizar la optogenética inalámbrica combinada con videografía de alta velocidad en una sola tarea de alcance a agarre de pellets para caracterizar los circuitos neuronales involucrados en el rendimiento del comportamiento motor hábil en ratones que se mueven libremente.
Abstract
Las habilidades motoras finas son esenciales en la vida cotidiana y pueden verse comprometidas en varios trastornos del sistema nervioso. La adquisición y realización de estas tareas requieren integración sensorio-motora e implican un control preciso de los circuitos cerebrales bilaterales. La implementación de paradigmas conductuales unimanuales en modelos animales mejorará la comprensión de la contribución de las estructuras cerebrales, como el cuerpo estriado, al comportamiento motor complejo, ya que permite la manipulación y el registro de la actividad neuronal de núcleos específicos en condiciones de control y enfermedades durante el desempeño de la tarea.
Desde su creación, la optogenética ha sido una herramienta dominante para interrogar al cerebro al permitir la activación o inhibición selectiva y dirigida de las poblaciones neuronales. La combinación de optogenética con ensayos conductuales arroja luz sobre los mecanismos subyacentes de funciones cerebrales específicas. Los sistemas inalámbricos montados en la cabeza con diodos emisores de luz (LED) miniaturizados permiten el control optogenético remoto en un animal que se mueve completamente libremente. Esto evita que las limitaciones de un sistema cableado sean menos restrictivas para el comportamiento de los animales sin comprometer la eficiencia de emisión de luz. El protocolo actual combina un enfoque de optogenética inalámbrica con videografía de alta velocidad en una tarea de destreza unimanual para diseccionar la contribución de poblaciones neuronales específicas al comportamiento motor fino.
Introduction
El comportamiento hábil motor está presente durante la mayoría de los movimientos realizados por nosotros, y se sabe que se ve afectado en varios trastornos cerebrales 1,2,3,4,5,6. La implementación de tareas que permitan estudiar el desarrollo, el aprendizaje y el rendimiento de movimientos hábiles es crucial para comprender los fundamentos neurobiológicos de la función motora, especialmente en modelos de lesiones cerebrales, trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo 2,7,8,9,10,11,12,13 . Alcanzar y recuperar objetos se realiza de forma rutinaria en las acciones de la vida cotidiana, y es una de las primeras habilidades motoras adquiridas durante el desarrollo temprano y luego refinadas a través de los años 5,6. Comprende un comportamiento complejo que requiere procesos sensorio-motores como la percepción de las características del objeto, la planificación del movimiento, la selección de la acción, la ejecución del movimiento, la coordinación corporal y la modulación de la velocidad 7,14,15,16. Por lo tanto, las tareas unimanuales de alta destreza requieren la participación de muchas estructuras cerebrales de ambos hemisferios 16,17,18,19,20,21,22. En ratones, la tarea de alcance a agarre de un solo pellet se caracteriza por varias fases que pueden controlarse y analizarse por separado 7,13,23. Esta característica permite estudiar la contribución de subpoblaciones neuronales específicas en diferentes etapas de adquisición y rendimiento conductual y proporciona una plataforma para estudios detallados de los sistemas motores 13,23,24. El movimiento se produce en un par de segundos; por lo tanto, la videografía de alta velocidad debe utilizarse para el análisis cinemático en distintas etapas de la trayectoria motora calificada 7,25. Se pueden extraer varios parámetros de los videos, incluida la postura corporal, la trayectoria, la velocidad y el tipo de errores25. El análisis cinemático se puede utilizar para detectar cambios sutiles durante la manipulación optogenética inalámbrica 7,23.
El uso de diodos emisores de luz (LED) miniaturizados para entregar luz a través de un sistema inalámbrico montado en la cabeza permite tener un control optogenético remoto mientras el animal realiza la tarea. El controlador optogenético inalámbrico acepta comandos de disparo continuo o de un solo pulso de un estimulador y envía señales infrarrojas (IR) a un receptor conectado al LED miniaturizado23,26. El protocolo actual combina este enfoque de optogenética inalámbrica con videografía de alta velocidad de una tarea de destreza para diseccionar el papel de poblaciones neuronales específicas durante el desempeño del comportamiento motor fino23. Dado que es una tarea unimanual, permite evaluar la participación de estructuras en ambos hemisferios. Tradicionalmente, el cerebro controla el movimiento del cuerpo de una manera altamente asimétrica; sin embargo, las tareas de alta destreza requieren una coordinación y control cuidadosos de muchas estructuras cerebrales, incluidos los núcleos ipsilaterales y la contribución diferencial de las subpoblaciones neuronales dentro de los núcleos 10,20,21,22,23. Este protocolo muestra que las estructuras subcorticales de ambos hemisferios controlan la trayectoria de la extremidad anterior23. Este paradigma puede ser adecuado para estudiar otras regiones del cerebro y modelos de enfermedad cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de la manipulación optogenética de poblaciones neuronales en paradigmas conductuales bien definidos está avanzando en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes al control motor 7,23. Los métodos inalámbricos son especialmente adecuados para tareas que requieren pruebas en múltiples animales o libre movimiento34,35. Sin embargo, a medida que se refinan las técnicas y los dispositi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el proyecto UNAM-PAPIIT IA203520. Agradecemos a la instalación de animales de IFC por su ayuda con el mantenimiento de las colonias de ratones y a la unidad computacional por el apoyo de TI, especialmente a Francisco Pérez-Eugenio.
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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