Vivo में वायरलेस Optogenetic कुशल मोटर व्यवहार के नियंत्रण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में कुशल मोटर व्यवहार के प्रदर्शन में शामिल तंत्रिका सर्किट को चिह्नित करने के लिए एक ही गोली पहुंच-से-समझ कार्य में उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ संयुक्त वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग कैसे किया जाए।
Abstract
ठीक मोटर कौशल रोजमर्रा की जिंदगी में आवश्यक हैं और कई तंत्रिका तंत्र विकारों में समझौता किया जा सकता है। इन कार्यों के अधिग्रहण और प्रदर्शन के लिए संवेदी-मोटर एकीकरण की आवश्यकता होती है और इसमें द्विपक्षीय मस्तिष्क सर्किट का सटीक नियंत्रण शामिल होता है। पशु मॉडल में unimanual व्यवहार प्रतिमानों को लागू करने से मस्तिष्क संरचनाओं के योगदान की समझ में सुधार होगा, जैसे कि स्ट्रिएटम, जटिल मोटर व्यवहार के लिए क्योंकि यह कार्य के प्रदर्शन के दौरान नियंत्रण स्थितियों और बीमारी में विशिष्ट नाभिक की तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर और रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।
इसके निर्माण के बाद से, ऑप्टोजेनेटिक्स न्यूरोनल आबादी के चयनात्मक और लक्षित सक्रियण या निषेध को सक्षम करके मस्तिष्क से पूछताछ करने के लिए एक प्रमुख उपकरण रहा है। व्यवहार assays के साथ optogenetics का संयोजन विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों के अंतर्निहित तंत्र पर प्रकाश डालता है। लघुकृत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ वायरलेस हेड-माउंटेड सिस्टम पूरी तरह से मुक्त-चलती जानवर में दूरस्थ ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण की अनुमति देते हैं। यह प्रकाश उत्सर्जन दक्षता से समझौता किए बिना जानवरों के व्यवहार के लिए कम प्रतिबंधात्मक होने के कारण वायर्ड सिस्टम की सीमाओं से बचता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक यूनिमैनुअल निपुणता कार्य में उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ एक वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स दृष्टिकोण को जोड़ता है ताकि ठीक मोटर व्यवहार के लिए विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के योगदान को विच्छेदित किया जा सके।
Introduction
मोटर कुशल व्यवहार हमारे द्वारा किए गए अधिकांश आंदोलनों के दौरान मौजूद होता है, और यह कई मस्तिष्क विकारों 1,2,3,4,5,6 में प्रभावित होने के लिए जाना जाता है। कुशल आंदोलनों के विकास, सीखने और प्रदर्शन का अध्ययन करने की अनुमति देने वाले कार्यों को लागू करना मोटर फ़ंक्शन के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से मस्तिष्क की चोट, न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के मॉडल में 2,7,8,9,10,11,12,13 . वस्तुओं तक पहुंचना और पुनर्प्राप्त करना रोजमर्रा की जिंदगी के कार्यों में नियमित रूप से किया जाता है, और यह शुरुआती विकास के दौरान हासिल किए गए पहले मोटर कौशल में से एक है और फिर 5,6 वर्षों के माध्यम से परिष्कृत किया जाता है। इसमें एक जटिल व्यवहार शामिल है जिसमें संवेदी-मोटर प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है जैसे कि वस्तु की विशेषताओं की धारणा, आंदोलन योजना, कार्रवाई चयन, आंदोलन निष्पादन, शरीर समन्वय, और गति मॉडुलन 7,14,15,16। इस प्रकार, unimanual उच्च निपुणता कार्यों के लिए दोनों गोलार्धों की कई मस्तिष्क संरचनाओं की भागीदारी की आवश्यकता होती है 16,17,18,19,20,21,22। चूहों में, एकल गोली पहुंच-से-समझ कार्य को कई चरणों के लिए विशेषता है जिसेअलग-अलग 7,13,23 नियंत्रित और विश्लेषण किया जा सकता है। यह सुविधा अधिग्रहण और व्यवहार प्रदर्शन के विभिन्न चरणों में विशिष्ट न्यूरोनल उप-आबादी के योगदान का अध्ययन करने की अनुमति देती है और मोटर सिस्टम13,23,24 के विस्तृत अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करती है। आंदोलन कुछ सेकंड में होता है; इस प्रकार, उच्च गति की वीडियोग्राफी का उपयोग कुशल मोटर प्रक्षेपवक्र 7,25 के विभिन्न चरणों में कीनेमेटिक विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए। वीडियो से कई पैरामीटर निकाले जा सकते हैं, जिसमें शरीर की मुद्रा, प्रक्षेपवक्र, वेग और त्रुटियों के प्रकार25 शामिल हैं। कीनेमेटिक विश्लेषण का उपयोग वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर 7,23 के दौरान सूक्ष्मपरिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
एक वायरलेस हेड-माउंटेड सिस्टम के माध्यम से प्रकाश वितरित करने के लिए लघुकृत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) का उपयोग करना दूरस्थ ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण करना संभव बनाता है जबकि जानवर कार्य करता है। वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रक एक उत्तेजक से एकल-नाड़ी या निरंतर ट्रिगर कमांड स्वीकार करता है और लघुकृत एलईडी23,26 से जुड़े रिसीवर को अवरक्त (आईआर) संकेत भेजता है। वर्तमान प्रोटोकॉल इस वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स दृष्टिकोण को एक निपुणता कार्य की उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ जोड़ता है ताकि ठीक मोटर व्यवहार के प्रदर्शन के दौरान विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की भूमिका को विच्छेदित कियाजा सके। चूंकि यह एक यूनिमैनुअल कार्य है, इसलिए यह दोनों गोलार्धों में संरचनाओं की भागीदारी का आकलन करने की अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, मस्तिष्क अत्यधिक असममित तरीके से शरीर के आंदोलन को नियंत्रित करता है; हालांकि, उच्च निपुणता कार्यों के लिए कई मस्तिष्क संरचनाओं से सावधानीपूर्वक समन्वय और नियंत्रण की आवश्यकता होती है, जिसमें इप्सिलेटरल नाभिक और नाभिक 10,20,21,22,23 के भीतर न्यूरोनल उप-आबादी का विभेदक योगदान शामिल है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि दोनों गोलार्धों से सबकॉर्टिकल संरचनाएं फोरलिम्ब23 के प्रक्षेपवक्र को नियंत्रित करती हैं। यह प्रतिमान अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों और मस्तिष्क रोग के मॉडल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार प्रतिमानों में न्यूरोनल आबादी के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर का उपयोग मोटर नियंत्रण 7,23 के अंतर्निहित तंत्रके बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ा रहा है। वाय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को UNAM-PAPIIT परियोजना IA203520 द्वारा समर्थित किया गया था। हम माउस उपनिवेशों के रखरखाव और आईटी समर्थन के लिए कम्प्यूटेशनल इकाई के साथ उनकी मदद के लिए आईएफसी पशु सुविधा को धन्यवाद देते हैं, विशेष रूप से फ्रांसिस्को पेरेज़-यूजीनियो के लिए।
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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