Det nuvarande protokollet beskriver hur man använder trådlös optogenetik i kombination med höghastighetsvideoografi i en enda pellets nå-till-grepp-uppgift för att karakterisera de neurala kretsarna som är involverade i utförandet av skickligt motoriskt beteende hos fritt rörliga möss.
Finmotorik är viktigt i vardagen och kan äventyras vid flera nervsystemet. Förvärvet och utförandet av dessa uppgifter kräver sensorisk-motorisk integration och involverar exakt kontroll av bilaterala hjärnkretsar. Implementering av unimanuella beteendeparadigmer i djurmodeller kommer att förbättra förståelsen för bidraget från hjärnstrukturer, som striatum, till komplext motoriskt beteende eftersom det möjliggör manipulation och registrering av neural aktivitet hos specifika kärnor under kontrollförhållanden och sjukdom under utförandet av uppgiften.
Sedan dess skapande har optogenetik varit ett dominerande verktyg för att förhöra hjärnan genom att möjliggöra selektiv och riktad aktivering eller hämning av neuronala populationer. Kombinationen av optogenetik med beteendeanalyser belyser de underliggande mekanismerna för specifika hjärnfunktioner. Trådlösa huvudmonterade system med miniatyriserade lysdioder (LED) möjliggör fjärroptogenetisk kontroll i ett helt fritt rörligt djur. Detta undviker att begränsningarna i ett trådbundet system är mindre restriktiva för djurens beteende utan att kompromissa med ljusutsläppseffektiviteten. Det nuvarande protokollet kombinerar ett trådlöst optogenetiskt tillvägagångssätt med höghastighets videografi i en enmanuell fingerfärdighetsuppgift för att dissekera bidraget från specifika neuronala populationer till finmotoriskt beteende.
Motoriskt skickligt beteende är närvarande under de flesta rörelser som utförs av oss, och det är känt att det påverkas i flera hjärnsjukdomar 1,2,3,4,5,6. Att implementera uppgifter som gör det möjligt att studera utveckling, inlärning och prestanda av skickliga rörelser är avgörande för att förstå motorfunktionens neurobiologiska underlag, särskilt i modeller av hjärnskada, neurodegenerativa och neurodevelopmental störningar 2,7,8,9,10,11,12,13 . Att nå och hämta föremål görs rutinmässigt i vardagliga handlingar, och det är en av de första motoriska färdigheterna som förvärvats under tidig utveckling och sedan förfinats genom åren 5,6. Det består av ett komplext beteende som kräver sensoriska motoriska processer såsom uppfattningen av objektets funktioner, rörelseplanering, åtgärdsval, rörelseutförande, kroppskoordination och hastighetsmodulering 7,14,15,16. Således kräver unimanuella uppgifter med hög fingerfärdighet deltagande av många hjärnstrukturer i båda halvklotet 16,17,18,19,20,21,22. Hos möss karakteriseras den enda pellets nå-till-grepp-uppgiften för flera faser som kan styras och analyseras separat 7,13,23. Denna funktion gör det möjligt att studera bidraget från specifika neuronala delpopulationer vid olika stadier av förvärv och beteendeprestanda och ger en plattform för detaljerade studier av motorsystem 13,23,24. Rörelsen sker på några sekunder; således bör höghastighetsvideo användas för kinematisk analys i distinkta steg i den skickliga motorbanan 7,25. Flera parametrar kan extraheras från videorna, inklusive kroppshållning, bana, hastighet och typ av fel25. Kinematisk analys kan användas för att detektera subtila förändringar under trådlös optogenetisk manipulation 7,23.
Att använda miniatyriserade lysdioder (LED) för att leverera ljus via ett trådlöst huvudmonterat system gör det möjligt att ha fjärroptoneisk kontroll medan djuret utför uppgiften. Den trådlösa optogenetiska styrenheten accepterar kommandon med enkel puls eller kontinuerlig avtryckare från en stimulator och skickar infraröda (IR) signaler till en mottagare ansluten till den miniatyriseradeLED 23,26. Det nuvarande protokollet kombinerar detta trådlösa optogenetiska tillvägagångssätt med höghastighets videografi av en fingerfärdighetsuppgift för att dissekera rollen hos specifika neuronala populationer under utförandet av finmotoriskt beteende23. Eftersom det är en enmanuell uppgift möjliggör det att bedöma deltagandet av strukturer i båda halvklotet. Traditionellt styr hjärnan kroppsrörelsen på ett mycket asymmetriskt sätt; emellertid kräver uppgifter med hög fingerfärdighet noggrann samordning och kontroll från många hjärnstrukturer, inklusive ipsilaterala kärnor och differentiellt bidrag från neuronala subpopulationer inom kärnor 10,20,21,22,23. Detta protokoll visar att subkortiska strukturer från båda halvklotet styr banan för frambenet23. Detta paradigm kan vara lämpligt för att studera andra hjärnregioner och modeller av hjärnsjukdomar.
Användningen av optogenetisk manipulation av neuronala populationer i väldefinierade beteendeparadigmer främjar vår kunskap om mekanismerna bakom motorstyrning 7,23. Trådlösa metoder är särskilt lämpliga för uppgifter som kräver tester på flera djur eller fri rörlighet34,35. Men när tekniker och enheter förfinas bör det vara det bästa alternativet för alla beteendeuppgifter i kombination…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av UNAM-PAPIIT-projektet IA203520. Vi tackar IFC:s djuranläggning för deras hjälp med underhåll av muskolonier och beräkningsenheten för IT-support, särskilt till Francisco Perez-Eugenio.
Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
Anesket | PiSA | Ketamine | |
Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
Cotton swabs | |||
CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
Customized training chamber | In house | ||
Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
Infrared emmiter | Teleopto | ||
Insulin syringe | |||
LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
Microtome | |||
Mock receiver | Teleopto | ||
NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
Oxygen tank | Infra | na | |
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
Parafilm | |||
Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
Procin | PiSA | Xylacine | |
Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
Scalpel | |||
Scalpel blade | |||
Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
Surgical dispossable cap | |||
Teleopto remote controller | Teleopto | ||
Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |