Summary
DetectSyn er en objektiv, rask fluorescerende analyse som måler endringer i relativ synapse (pre- og postsynaptisk engasjement) antall på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander. Denne teknikken benytter en nærhet ligation teknikk som kan brukes både i dyrkede nevroner og fast vev.
Abstract
Synapser er stedet for kommunikasjon mellom nevroner. Nevronal kretsstyrke er relatert til synaptisk tetthet, og nedbrytningen av synapser er karakteristisk for sykdomstilstander som stor depressiv lidelse (MDD) og Alzheimers sykdom. Tradisjonelle teknikker for å undersøke synapsetall inkluderer genetisk uttrykk for fluorescerende markører (f.eks. grønt fluorescerende protein (GFP)), fargestoffer som fyller et nevron (f.eks. karbocyaninfarge, DiI) og immunfluorescerende deteksjon av ryggmarkører (f.eks. postsynaptisk tetthet 95 (PSD95)). En stor advarsel til disse proxy-teknikkene er at de bare identifiserer postsynaptiske endringer. Likevel er en synapse en forbindelse mellom en presynaptisk terminal og en postsynaptisk ryggrad. Gullstandarden for måling av synapsedannelse/eliminering krever tidkrevende elektronmikroskopi eller matrisetomografiteknikker. Disse teknikkene krever spesialisert opplæring og kostbart utstyr. Videre kan bare et begrenset antall nevroner vurderes og brukes til å representere endringer i en hel hjerneregion. DetectSyn er en rask fluorescerende teknikk som identifiserer endringer i synapsedannelse eller eliminering på grunn av en sykdomstilstand eller narkotikaaktivitet. DetectSyn benytter en rask nærhetsligasjonsanalyse for å oppdage sammenstilte pre- og postsynaptiske proteiner og standard fluorescerende mikroskopi, en teknikk som er lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. Fluorescerende deteksjon av den resulterende puncta gir rask og objektiv analyse av eksperimenter. DetectSyn gir mer representative resultater enn elektronmikroskopi fordi større områder kan analyseres enn et begrenset antall fluorescerende nevroner. Videre fungerer DetectSyn for in vitro-dyrkede nevroner og faste vevsskiver. Til slutt er det gitt en metode for å analysere dataene som samles inn fra denne teknikken. Totalt sett tilbyr DetectSyn en prosedyre for å oppdage relative endringer i synapsetetthet på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander og er mer tilgjengelig enn tradisjonelle teknikker.
Introduction
Synapser er den grunnleggende kommunikasjonsenheten mellom nevroner1. Mange synapser mellom nevroner i de samme regionene gir opphav til kretser som formidler atferd2. Synapser består av en presynaptisk terminal fra en nevron som frigjør nevrotransmittere eller nevropeptider som videresender informasjon til postsynaptiske reseptorer av en annen nevron. Oppsummeringen av presynaptiske signaler bestemmer om den postsynaptiske nevronen vil avfyre et handlingspotensial og forplante meldingen til andre nevroner.
Synaptopatologi, nedbrudd av synapser, oppstår i sykdommer og lidelser preget av redusert nevralt volum, som Alzheimers sykdom og stor depressiv lidelse, noe som resulterer i kretser som ikke lenger optimalt utfører 3,4,5. Gjenoppretting av synapsetetthet ligger sannsynligvis til grunn for effekten av potensielle behandlinger for disse lidelsene. For eksempel ble det nylig demonstrert at økende synapser ligger til grunn for atferdseffekten av raske antidepressiva6. For raskt å screene mulige synaptopatologibehandlinger, krever forskere teknikker som raskt identifiserer endringer i synapsetall.
Nåværende metoder er enten tidkrevende og dyre (elektronmikroskopi, matrisetomografi), eller de undersøker bare postsynaptiske endringer uten å inkorporere presynaptisk engasjement (rygganalyser, immunfluorescens/colokalisering). Fargestoffer som DiI eller fluorescerende proteiner som GFP bidrar til å visualisere nevroner og karakterisere postsynaptiske spines. Ryggradsanalysen bruker imidlertid forskerdefinerte forhold for å bestemme morfologi, noe som kan redusere reproduserbarheten7. Videre blir det fortsatt avdekket hvordan de forskjellige ryggradsklassene forholder seg til funksjonelle synapser. Ryggradsdannelse kan være forbigående og kan reflektere postsynaptisk plastisitet, men disse ryggradene kan elimineres før de stabiliseres til en synapse med en presynaptisk nevron9.
Colocalization gir en bedre proxy for synapser enn ryggradsanalyse fordi man kan immunostain for presynaptiske og postsynaptiske proteiner. Synaptiske proteiner kan imidlertid gi lave colokaliseringsverdier fordi proteinene er sammenstilt og kanskje ikke overlapper konsekvent. Således, fordi proteinene ikke er helt overliggende, kan colokaliseringsteknikker ikke nøyaktig måle endringer i synapsedannelse på grunn av denne manglende informasjonen. Til slutt, selv om både elektronmikroskopi (EM) og matrisetomografi gir høyoppløselige bilder av synapser, er de tidkrevende. EM krever videre spesialisert utstyr, og forskere er begrenset til små mengder vev for et gitt eksperiment. Mens matrisetomografi elegant gir muligheten til å screene for mange proteiner på ultratynne seksjoner og kan kombineres med EM10, kan denne teknikken være for arbeidskrevende og utenfor omfanget av eksperimenter som må skannes raskt for endringer i synapsedannelse.
DetectSyn er en spesifikk anvendelse av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen muliggjør generell påvisning av proteinproteininteraksjoner. DetectSyn bridges proxy postsynaptiske tiltak ved å forsterke et fluorescerende signal som slippes ut av taggede pre- og postsynaptiske proteiner innen 40 nm fra hverandre. Hvis de synaptiske proteinene er innenfor 40 nm, som innenfor en synaptisk kløft, vil de sekundære antistoffene, som inneholder DNA-sonder, hybridisere til sirkulært DNA. Dette hybridiserte sirkulære DNA-et uttrykker en fluorescerende sonde, som deretter forsterkes og oppdages med standard fluorescerende mikroskopiteknikker (se figur 1). Avgjørende, i motsetning til EM og matrisetomografi, krever denne teknikken ikke spesialisert utstyr og tar omtrent samme tid som standard immunhiistokjemi. Tilgjengeligheten av denne teknikken gjør det dermed mulig for etterforskere utenfor forskningsintensive institusjoner å delta i synaptopatologiforskning. Videre kan denne teknikken undersøke endringer i synaptisk tetthet i flere hjerneregioner i et enkelt eksperiment, og tilbyr en mer helhetlig representasjon av synaptiske endringer på grunn av sykdom eller behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Isolering av celler og vev fra dyr var i samsvar med National Institutes of Health's Guide for care and use of Laboratory Animals og godkjent av Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
MERK: Denne protokollen brukes på prøver som allerede er behandlet og fikset i henhold til spesifikke eksperimentelle paradigmer og krav. For demonstrasjonsformål brukes synapsedannelse på grunn av rask antidepressiv behandling til å markere denne synapsedeteksjonsteknikken6. Nevroner som tidligere var dyrket på deksler, behandlet, festet i 4% paraformaldehyd (PFA), og lagret i 1x fosfatbufret saltvann (PBS), vil bli brukt til å markere in vitro-prosedyrene. Tidligere skiver hippocampal vev (25 μm tykt) fra mus behandlet, transkarialt perfused med iskald PBS og 4% PFA, og deretter lagret i kryotopektant vil bli brukt til å markere skiveprosedyrer. Vennligst se 11,12 for mer informasjon om hvordan du kan dyrke nevroner eller transkardielt parfyme gnagere. Se figur 1 hvis du vil ha en grafisk fremstilling av denne prosedyren.
Figur 1: Grafisk fremstilling av DetectSyn-analysen. Etter permeabiliserende cellemembraner binder primære antistoffer for Synapsin1 og PSD95 seg til disse synaptiske proteinene. Secondaries med oligonukleotid tags deretter binde til de primære antistoffer. Hvis Synapsin1 og PSD95 er innenfor 40 nm, som ved en synapse, samhandler oligonukleotidene, og en fluorescerende tag forsterkes. Dette fluorescerende signalet kan deretter avbildes via standard mikroskopi og analyseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Skyll prøver
- Skyll prøvene med 500 μL 1x PBS + 0,75% glycin i 5 min 3 ganger med mild agitasjon på en orbital shaker for å fjerne gjenværende PFA eller kryotopektant.
2. Blokker og permeabilisere prøver
- Forbered blokkerings- og permeabiliseringsløsning (10 % normalt eselserum, 0,25 % Tween 20) i 1x PBS. Forbered nok til å brukes til blokkering, primær og sekundær inkubasjoner.
- Til prøver (f.eks. deksler eller frittflytende skiver) i 24 brønnplater, tilsett 500 μL blokkerings- og permeabiliseringsløsning. Forsikre deg om at hver brønn inneholder en annen prøve og er riktig merket for å forhindre at prøver byttes.
- Inkuber prøvene ved romtemperatur (RT) i 60 min for dyrkede celler eller 2 timer for skiver vev. Bruk en orbital shaker for mild agitasjon.
3. Inkubere prøver i primære antistoffer
- Forbered primære antistoffer i blokkeringsbuffer:
- Forbered postsynaptisk tetthet 95 (PSD95; 1:500, kaninpolyklonal), Synapsin1 (1:500, musmonoklonal), MAP2 (1:400, kyllingpolyklonal)
- Klargjøre en negativ kontroll aliquot som utelater et av de synaptiske parene (f.eks. uten PSD95)
- Fjern forsiktig blokkeringsløsningen med en pasteurpipette av plast. Prøv å fjerne så mye som mulig uten å forstyrre cellene eller rive vev.
- For dyrkede celler:
- Line en stor plast petriskål med parafilm. Overfør forsiktig deksler til parafilmen ved hjelp av tang.
- Tilsett forsiktig 60 μL av den primære antistoffløsningen til toppen av dekslene. Pass på at du ikke søler den primære antistoffløsningen over siden av dekslene.
- For å gi fuktighet og forhindre at prøver tørker ut i inkubasjonsperioden, tilsett ultrarent vann til en mindre Petri-tallerken og ordne forsiktig den lille Petri-parabolen rundt dekslene.
- Dekk den store Petri-parabolen og inkuber dyrkede celler i 1 time ved RT.
- For skiver vev:
- Tilsett forsiktig 250 μL av den primære antistoffløsningen til frittflytende skiver i en 24 brønnplate.
- Dekk platen og inkuber vevet over natten ved 4 °C med mild agitasjon på en orbital shaker.
4. Vask prøver, og inkuber deretter i sekundære antistoffer
- Forbered sekundære antistoffer i blokkeringsbufferen:
- Forbered esel anti-mus (1:5), esel anti-kanin (1:5), esel anti-kylling (1:400).
- På dette trinnet kan ytterligere tekniske kontroller oppnås ved å forberede en sekundær aliquot som utelater enten antimus eller anti-kanin sekundær.
- For dyrkede celler:
- Bruk tang, og trykk forsiktig av den primære løsningen fra deksler på et papirhåndkle
- Bruk tang til å overføre dekslene forsiktig tilbake til den originale 24 brønnplaten fylt med 500 μL 1x PBS.
- For skiver vev:
- Fjern forsiktig den primære antistoffløsningen med en pasteurpipette av plast. Prøv å fjerne så mye som mulig uten å rive vev.
- Tilsett 500 μL 1x PBS
- Vask prøvene i 10 min 3 ganger i 1x PBS med skånsom agitasjon på en orbital shaker. I løpet av denne tiden, ta alle vaskebuffere til RT.
- I løpet av denne tiden, endre parafilmen i den store Petri parabolen
- For dyrkede celler:
- Bruk tang, overfør forsiktig dekslene tilbake til den parafilmede store Petri-parabolen
- Tilsett forsiktig 40 μL av den sekundære antistoffløsningen til toppen av dekslene. Pass på at du ikke søler den sekundære antistoffløsningen over siden av dekslene.
- Om nødvendig, tilsett mer ultrapure vann til en mindre petriskål og ordne forsiktig den lille petriskålen rundt deksler.
- Dekk den store Petri-retten
- For skiver vev:
- Tilsett forsiktig 250 μL av den sekundære antistoffløsningen til frittflytende skiver i en 24 brønnplate.
- Dekk til platen
MERK: Fra nå av beskytter du prøvene mot lys ved å pakke toppen av platene med folie.
- Inkuber prøvene ved 37 °C i 1 time
5. Ligasjon
- Bland ligasjonsbestanden 1:5 i molekylært vann.
- Som i avsnitt 4, overfør forsiktig dekslene og fjern sekundærblandingen fra det skiver vevet.
- Vask prøvene i 500 μL vaskebuffer A
- For dyrkede celler, vask 2 ganger i 5 min. For skiver vev, vask 2 ganger i 10 min. Bruk mild agitasjon på en orbital shaker for begge deler.
- I løpet av denne tiden, endre parafilmen i den store Petri parabolen
- Mens du holder ligaene på en kald blokk, fortynn ligase 1:40 i ligasjonsbestanden fra trinn 5.1. Utfør denne fortynning umiddelbart før du legger ligase til prøvene.
- Som i avsnitt 4, fjern så mye av vaskebufferen A som mulig fra prøver før du legger til ligase.
- For dyrkede celler: Overfør deksler tilbake til den parafilmede Petri-parabolen. Tilsett 40 μL av ligationblandingen til deksler, ordne små vannfylte Petri-retter rundt dekslene, og dekk den store Petri-parabolen.
- For skiver vev: Tilsett 250 μL av ligasjonsblandingen fra trinn 5.4 til hver brønn og dekk platen.
- Inkuber prøvene i 30 min ved 37 °C.
6. Forsterkning
- Bland forsterkningsmassen 1:5 i molekylært vann.
- Som i avsnitt 4, overfør forsiktig dekslene og fjern ligasjonsblandingen fra det skiver vevet.
- Vask prøver i 500 μL vaskebuffer A
- For dyrkede celler, vask 2 ganger i 2 min. For skiver vev, vask 2 ganger i 10 min. Bruk mild agitasjon på en orbital shaker for begge deler.
- I løpet av denne tiden, endre parafilmen i den store Petri parabolen
- Utfør denne fortynning umiddelbart før du legger polymerasen til prøver. Mens du holder polymerasen på en kald blokk, fortynn polymerase
- For dyrkede celler, fortynn polymerase 1:80 i forsterkningsmassen fra trinn 6.1.
- For skiver vev, fortynn polymerase 1:40 i forsterkningsmassen fra trinn 6.1.
- Som i trinn 4, fjern så mye av vaskebufferen A som mulig fra prøver før du legger til polymerasen.
- For dyrkede celler: Overfør dekslene tilbake til den parafilmede Petri-parabolen. Tilsett 40 μL av forsterkningsblandingen fra trinn 6.4.1 til deksler, ordne små vannfylte Petri-retter rundt dekslene og dekk til den store Petri-parabolen. Inkuber prøvene i 100 min ved 37 °C.
- For skiver vev: Tilsett 250 μL av forsterkningsblandingen fra trinn 6.4.2 til hver brønn og dekk platen. Inkuber prøvene i 2 timer ved 37 °C.
MERK: I løpet av denne tiden forbereder og merker du lysbilder.
7. Montering
- Som i trinn 4, overfør forsiktig dekslene og fjern forsterkningsblandingen fra det skiver vevet.
- Vask prøvene i 500 μL vaskebuffer B 2 ganger i 10 minutter med skånsom agitasjon på en orbital shaker.
- Vask prøvene i 500 μL 1% vaskebuffer B i 1 min med mild agitasjon på en orbital shaker.
- For dyrkede celler:
- Slipp 3 μL monteringsmedier på et lysbilde
- Trykk av overflødig vaskebuffer fra dekslene, og plasser deretter dekslene (med celler vendt ned) i monteringsmediet. Forsegle sidene med en liten mengde klar neglelakk for å forsegle dekslene på plass.
- For skiver vev:
- Overfør forsiktig en vevskive til den forberedte lysbildet og ordne det, slik at skiven ligger flatt. Slipp mellom 5-10 μL monteringsmedier (mengden vil avhenge av størrelsen på stykket) på vevsskiven
- Legg forsiktig et glassdeksle over vevsskiven og forsegle med en liten mengde klar neglelakk langs kanten for å forsegle dekslene på plass.
- Vent minst 15 minutter før du analyserer under mikroskopet, eller oppbevar ved -20 °C.
8. Få digitale bilder med et konfokalt mikroskop
- Optimaliser anskaffelsesinnstillingene (f.eks. lasereffekt, forsterkning, offset) på tvers av prøver fra alle behandlinger. Forsikre deg om at optimaliseringen inkluderer å redusere bakgrunnsstøy og forbedre signalet uten å overmete intensiteten til fluorescerende signaler. Når innstillingene er bestemt, bruker du de samme anskaffelsesinnstillingene på tvers av alle oppnådde bilder.
MERK: Følgende anskaffelsesdetaljer kan brukes med et Nikon A1 konfokalt mikroskop og Nikon NIS AR Elements-programvaren. - Still inn lysbildet med prøve på scenen og finn fokusplanet for prøven ved hjelp av DAPI gjennom okularet.
- Slå av øyeporten ved å klikke på Eye-porten og velg en optisk konfigurasjonsknapp for å justere innstillingene.
- Juster forsterknings-, forskyvnings- og lasereffekten for hver fluorescerende kanal for å redusere bakgrunnsstøy og forbedre fluorescerende signal. Pass på at lysstoffrørsignalet ikke blir overmettet som nevnt i trinn 8.5-8.6.
- Overmetning ved hjelp av en pseudofarge for fluorescerende signal. Nederst i det direktesendte bildet høyreklikker du fanen merket med den fluorescerende kanalen som brukes.
- Velg deretter Kanalfarging og velg en pseudofarge som Rainbow Dark for å visualisere fluorescensintensiteten i en varmekartlignende pseudofarge. I Rainbow Dark indikerer kjøligere farger mindre fluorescerende intensitet, og varmere farger indikerer mer fluorescerende intensitet.
- Når alle fluorescerende kanaler er optimalisert, høyreklikker du på den optiske konfigurasjonsknappen som tidligere ble valgt, og velger Tilordne gjeldende kamerainnstilling for denne knappen.
- Kontroller at de valgte innstillingene er tilstrekkelige for en tilfeldig prøve fra hver behandlingsgruppe. Hvis de valgte innstillingene overmetter noen av disse eksemplene, gjentar du trinn 8.4 for å eliminere overmetningen.
- For dyrkede nevroner, følg trinn 8.10-8.16.
- Bruk øyeporten, søk etter en nevron med dendritter som har minimal overlapping med andre dendritter.
- Slå av øyeporten og bruk DAPI-kanalen til å visualisere cellekroppen til den valgte nevronen. Dobbeltklikk på midten av soma for å midtstille nevronen midt i synsfeltet.
- Bruk MAP2-kanalen til å finne det beste fokusplanet for MAP2-signalet med direkte skanning.
- Under ND Acquisition-fanen klikker du på Lagre i fil og velger en fil du vil lagre bildet i under Bla gjennom. Deretter skriver du inn filnavnet.
- Velg alternativet Symmetrisk modus definert etter område under Z-fanen. Sett fokus til det beste MAP2-planet, og klikk på Relative-knappen for å angi dette fokusplanet som midt i z-stabelen.
- Sett området til 5 μm med 1 μm trinn, og sørg for å sjekke Lukk aktiv lukker under Z-bevegelse. Under Wavelength-fanen velger du navnet på den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under Optisk konfekt. Klikk deretter på Kjør nå.
- Gjenta trinn 8.1.10-8.1.15 for ca. 10 nevroner per deksler/behandling.
- For skiver vev, følg trinn 8.18-8.22.
- Bruk øyeporten til å søke etter interesseområdet. For eksempel, finn CA1 av hippocampus.
- Slå av øyeporten og bruk MAP2-kanalen til å finne det beste fokusplanet for MAP2-signalet med direkte skanning.
- Velg Skann stort bilde på Hent-menyen. Velg deretter navnet på den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under Opptak-panelet fra panelet som åpnes. Sørg også for å velge riktig mål i dette panelet.
- Under områdepanelet og okularet bruker du piltastene til å sette grensene for interesseområdet. Deretter klikker du på Lagre stort bilde til fil og oppretter et lagringsbanefilnavn for bildet.
- Kontroller at det er merket av for Flerkanalsopptak under Oppsett-panelet, og velg deretter navnet på den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under Optisk konfekt.
MERK: En z-stakk for et stort bilde er mulig, men vil øke skannetiden.
9. Analyse
- I likhet med anskaffelsesinnstillinger, bruk prøver fra alle behandlinger for å optimalisere terskelinnstillingene. Sørg for at terskeloptimaliseringen fokuserer på å redusere bakgrunnsstøy og forbedre signalet uten å overmete intensiteten til fluorescerende signaler. Når disse innstillingene er bestemt, bruker du de samme terskelinnstillingene på tvers av alle bilder som brukes til analyse, som beskrevet i trinn 9.2-9.3.
- I ImageJ finner du terskelalternativet under menyen Bilde > Juster > terskelverdi. Velg alternativet Mørk bakgrunn hvis bildet har en mørk bakgrunn.
- Deretter justerer du de øvre og nedre grensene for terskelen per tidligere bestemte optimaliserte terskelinnstillinger, og deretter klikker du på Bruk.
- For dyrkede celler bruker du MAP2-kanalen og et roi-verktøy (freehand region of interest) til å tegne en avkastning for hver nevron, inkludert dendritter og soma. For skiver vev, tegn en frihånds avkastning i stykkebildet som innkapsler interesseområdet (f.eks. stratum radiatum av CA1 i hippocampus).
- Få tak i arealet av avkastningen. I ImageJ måler du området under menyen Analyser > mål.
- Oppdag antall punkteringer i hver avkastning ved hjelp av et automatisk deteksjonsverktøy som partikkelanalyse i ImageJ etter trinn 9.7-9.9.
- Finn alternativet Partikkelanalyse under menyen Analyser > analyser partikler. Først definerer du puncta størrelse diameter, vanligvis 0,1-3 μm2.
- Velg deretter alternativet Overleggsmasker på rullegardinmenyen Vis og merk av for Vis resultater. Klikk deretter på OK.
- Hvis puncta ikke oppdages med diameterområdet valgt, juster området til all puncta oppdages med denne analysen. Pass på at du bruker de samme partikkelanalyseinnstillingene for alle bilder.
- Del antall puncta etter området for en individuell interesseregion ved å følge trinn 9.11-9.13.
- Kopier og lim inn resultatene for hvert bilde fra popup-vinduet Resultater fra ImageJ i et regneark.
- Først må du identifisere hvilken fil og prøve dataene ble hentet fra. Deretter deler du arealet av avkastningen med antall puncta.
- Deretter fjerner du dataene fra popup-vinduet Resultater og gjentar trinn 9.2-9.12.
- Normaliser resultatene for å kontrollere prøver: Gjennomsnitt av resultatene (antall puncta/ROI-område) for kontrollprøvene. Deretter deler du de oppnådde resultatene av alle prøver med gjennomsnittet av kontrollen for å oppnå de normaliserte resultatene. Det nye gjennomsnittet av kontrollprøvene må være lik 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data modifisert fra Heaney et al.6 presenteres for å demonstrere et eksperiment der økt synapsedannelse forventes (se6 for mer informasjon og en mer grundig diskusjon av mekanismen). Tidligere ble det demonstrert at raske antidepressiva krever aktivering av den hemmende metabotrope reseptoren, GABAB (gamma-aminosmørsyre subtype B), for å være effektiv13. Videre indikerte tidligere data at raske antidepressiva øker postsynaptiske markører14; Dermed ble DetectSyn brukt til å teste hypotesen om at raske antidepressiva øker synapsetallene for å være effektive.
I dyrkede nevroner testes fire forhold. For det første, i topppanelet i figur 2A, ble kultiverte nevroner behandlet med kjøretøyet under samme forhold som den eksperimentelle kontrollen. PSD95s primære antistoff utelates imidlertid for å gi en teknisk kontroll for DetectSyn-analysen (se figur 1 for hvordan hver komponent bidrar til signalet). Deretter, i kontrollpanelet, blir nevroner igjen behandlet med kjøretøyet, men mottar både PSD95 og Synapsin1 primærvalg. Deretter behandles dyrkede nevroner bare med det raske antidepressive Ro-25-6981 (Ro) eller Ro pluss GABAB-agonisten, baclofen (Bac). Som tidligere vist13, er både det raske antidepressive Ro-25-6981 og GABAB agonist baclofen nødvendig for in vitro-effekten av Ro-25-6981. Dermed er en økning i synapseformasjonen demonstrert ved en økning i hvit puncta (figur 2A). Uten baklofen er det ikke sett noen økning i synapseformasjonen in vitro .
In vivo, basal GABA nivåer er tilstrekkelig for rask antidepressiv til å arbeide13, så bare den raske antidepressive Ro-25-6981 administreres via intraperitoneal injeksjon til mus (Figur 2B). Det venstre panelet i Fig. 2B representerer en annen teknisk kontroll for DetectSyn-analysen. Hippocampal vev fra en saltvannsbehandlet mus ble undersøkt med både primærvalg for PSD95 og Synapsin1, men en av de sekundære ble utelatt. En økning i synapsedannelse på grunn av behandling med det raske antidepressive Ro-25-6981 sammenlignet med saltvannsbehandlede mus er demonstrert i midtre og høyre paneler i figur 2B.
Representative bilder for tekniske kontroller in vitro og ex vivo vises. I figur 2A utelates en av primærene for synaptiske par (dvs. PSD95), og i figur 2B utelates en av de sekundære. Mens noen puncta vises i de tekniske kontrollbildene, er de generelt ikke av samme størrelse, som demonstrert av den hvite flekken i topppanelet i figur 2A sammenlignet med den store punctaen i de andre panelene. Videre er disse punctaene ikke på samme sted som puncta kvantifisert, som demonstrert av noen puncta som vises innenfor soma av den tekniske kontrollen i figur 2B. Vanligvis forekommer ikke-spesifikk puncta i kjernen, kanskje på grunn av tilstedeværelsen av DNA.
For å analysere de representative resultatene i figur 2A ble dendritter (visualisert ved MAP2-farging og representert her i en grå kontur) sporet ved hjelp av et frihåndstegningsverktøy for å skape interesseområder (ROIer). For det første ble området for MAP2-ROIene oppnådd ved hjelp av NIS Elements-funksjonen, ROI-data under kategorien Automatiserte måleresultater . Deretter ble puncta oppdaget ved hjelp av Thresholding-funksjonen i NIS Elements. Denne funksjonen oppretter en binær maske av objekter som faller innenfor en definert intensitetsterskel. Deretter ble antallet binære objekter i MAP2 ROIene oppdaget ved hjelp av NIS Elements-funksjonen, Binær i AVKASTNING, under kategorien Automatiserte måleresultater . Dataene som presenteres i grafen til høyre for figur 2A , er de normaliserte verdiene i punctaen delt på området av avkastningen.
For å analysere de representative resultatene i figur 2B ble stratumradiiatumet til CA1 sporet ved hjelp av et frihåndstegningsverktøy for å lage en avkastning. For det første ble området av avkastningen oppnådd ved hjelp av ROI-datafunksjonen, som beskrevet i avsnittet ovenfor. Deretter ble puncta oppdaget ved hjelp av Spot Detection - Bright Spots-funksjonen , som ligger under binærmenyen . Deretter ble diameter- og kontrastverdiene valgt basert på visuell inspeksjon av flere skiver fra alle behandlinger. Når disse verdiene ble bestemt, ble de brukt jevnt på tvers av alle analyserte bilder. Spot detection-funksjonen oppretter binære masker av objekter innenfor den definerte diameteren og kontrastparameterne som er angitt. Deretter ble antallet binære objekter i MAP2 ROIene oppdaget ved hjelp av NIS Elements-funksjonen, Binær i AVKASTNING, under kategorien Automatiserte måleresultater . Dataene som presenteres i grafen til høyre for figur 2B , er de normaliserte verdiene i punctaen delt på området av avkastningen.
Figur 2: Påvisning av synapser ved hjelp av DetectSyn-analyse. Hvit puncta representerer synapser oppdaget med DetectSyn PSD95-Synapsin1 nærhet ligation assay (gule pilspisser) i (A) in vitro dyrket primære hippocampal nevroner og (B) ex vivo CA1 stratum radiatum. I (A) representerer den grå omrisset MAP2-flekker. I (A) representerer det øverste panelet merket PLA-kontroll prøver som bare behandles med kjøretøy, som kontrollen. PSD95-primæren var imidlertid ikke inkludert i reaksjonen. I de to siste panelene ble nevroner behandlet med det raske antidepressive Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) eller Ro pluss GABAB agonist baclofen (Bac, 50 μM) i 90 min. Det økte antallet puncta (identifisert med gule pilspisser) indikerer at in vitro, synapsedannelse bare øker når det raske antidepressive Ro-25-6981 administreres med GABAB-agonisten. I (B) representerer grønt dendritter farget med MAP2, og blått representerer kjerner farget med DAPI. Enkle dendritter, skissert i gule rektangler i de sammenslåtte bildene, er isolert under representative bilder for å demonstrere at puncta lokaliserer til dendritter. Dyr ble behandlet med Ro-25-6981 (10 mg/kg), og vev ble samlet inn 45 min etter behandling. Det økte antallet puncta (identifisert av gule pilspisser) indikerer at in vivo, antall synapser øker med basal GABA-signalering og det raske antidepressive Ro-25-6981. Kvantifisering av representative resultater representeres av stolpediagrammene og angir gjennomsnittlig antall DetectSyn puncta delt på MAP2-området. Resultatene normaliseres til den eksperimentelle kontrollen. Bilder ble oppnådd ved hjelp av et Nikon A1plus konfokalt mikroskop. Skalastenger = (A) 10 μm; (B, topp) 50 μm; (B, bunn) 5 μm. Stolper representerer middelverdien +/- standardfeilen for gjennomsnittet. Resultater analysert av enveis ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 ved post hoc-analyse. Figuren er modifisert fra Heaney et al.6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DetectSyn er en rask analyse som bruker en nærhet ligation analyse for å oppdage proteiner innen 40 nm av hverandre, noe som gjør det mulig å oppdage synapsedannelse. Denne teknikken forbedrer dagens fluorescerende analyser, som bare fungerer som proxy-målinger for synapsedannelse. DetectSyn oppdager kvantifiserbare endringer i synaptiske proteiner lokalisert innen 40 nm, det vil si innenfor synaptisk kløft, av hverandre. Videre er DetectSyn mer kostnadseffektivt og tar mindre tid enn teknikker, som elektronmikroskopi og matrisetomografi, designet for å måle synapser og klassisk utpekt som gullstandardteknikker.
DetectSyn er en svært tilpassbar teknikk. Ethvert synaptisk par kan brukes til å identifisere dannelsen av bestemte typer synapser, så lenge proteinparet ligger innenfor 40 nm av hverandre. Selv om denne spennende teknikken har mange bruksområder, må man passe på å validere antistoffer, inkludert optimal blokkering og primære inkubasjonsforhold, og fortsette å støtte resultatene sine ved hjelp av andre metoder som immunfluorescens. Det foreslås å utføre disse støtteeksperimentene i separate eksperimenter som ikke bruker DetectSyn for å redusere antistoffbindingskonkurransen (f.eks. bruk av geit anti-PSD95 og mus anti-PSD95 i samme eksperiment kan redusere bindingen på grunn av konkurranse). I tillegg må du passe på å velge primære antistoffer oppdratt i forskjellige verter, for eksempel geit anti-PSD95 og kanin anti-Synapsin1. Hvis den samme verten brukes for begge primærvalgene, vil ikke de sekundære sondene diskriminere mellom de to primærvalgene.
Videre, fordi nærhet ligation har et forsterkning trinn, er det begrenset informasjon man kan trekke fra den resulterende puncta. For eksempel observeres punktkake i forskjellige størrelser (tydelig i figur 2B), noe som tyder på en endring i synapsestørrelse eller flere synapser rekruttert til samme område. Selv om hvert utvalg i et eksperiment gjennomgår de samme forholdene, gjør forsterkningstrinnet det imidlertid vanskelig å trekke disse konklusjonene kategorisk.
Til slutt inkluderer kritiske skritt for denne protokollen å sikre at ligaene og polymerasen forblir på en isblokk og legges så raskt som mulig til prøver. I tillegg vil inkludert tekniske kontroller bidra til å identifisere hvor ikke-spesifikk punktering kan vises i et gitt eksperiment. For eksempel, som vist i figur 2B, er puncta i kjerner sett i tekniske kontroller. Dermed er det avgjørende å inkludere negative eller tekniske kontroller for å sikre at signalet som oppdages i eksperimentelle prøver er større enn det som er sett i disse kontrollene. Disse tekniske kontrollene oppnås vanligvis ved å utelate et av primær- eller sekundærparene. Til slutt, sørg for at inkubasjonstemperaturen er ved 37 °C fra det sekundære trinnet.
Det er viktig at DetectSyn gir en tilgjengelig måte for nesten alle laboratorier med tilgang til et standard fluorescerende mikroskop, uavhengig av teknisk erfaring, for å studere synaptopatologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) og NS105005-03S1 (KRG), Forsvarsdepartementet USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), og et stipend fra FRAXA Research (CFH) og Alzheimers Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
