Préparation et élevage d’insectes axeniques avec des semis de culture tissulaire pour les études d’interaction entre le microbiote hôte et intestinal du coléoptère

Summary

Pour obtenir un insecte axenique, sa surface d’œuf est stérilisée et la larve éclose est ensuite élevée à l’aide de feuilles axeniques. Cette méthode fournit un moyen efficace pour la préparation d’insectes axeniques sans administrer d’antibiotiques ou développer un régime artificiel, qui peut également être appliqué à d’autres insectes mangeurs de feuilles.

Abstract

Les intestins des insectes sont colonisés par diverses bactéries qui peuvent avoir un impact profond sur les traits physiologiques de l’hôte. L’introduction d’une souche bactérienne particulière dans un insecte axenique est une méthode puissante pour vérifier la fonction microbienne intestinale et élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions intestin microbe-hôte. L’administration d’antibiotiques ou la stérilisation des surfaces des œufs sont deux méthodes couramment utilisées pour éliminer les bactéries intestinales des insectes. Cependant, en plus des effets indésirables potentiels des antibiotiques sur les insectes, des études antérieures ont indiqué que l’alimentation en antibiotiques ne pouvait pas éliminer les bactéries intestinales. Ainsi, les régimes artificiels sans germes sont généralement utilisés pour maintenir les insectes axeniques, ce qui est un processus fastidieux et laborieux qui ne peut pas ressembler pleinement aux composants nutritionnels des aliments naturels. Décrit ici est un protocole efficace et simple pour préparer et maintenir les larves axeniques d’un coléoptère (Plagiodera versicolora). Plus précisément, les surfaces des œufs de coléoptères ont été stérilisées, après quoi des feuilles de peuplier exemptes de germes ont été utilisées pour élever des larves d’axenique. Le statut axenique des insectes a ensuite été confirmé par des essais dépendants de la culture et indépendants de la culture. Collectivement, en combinant la désinfection des œufs et la culture sans germes, une méthode efficace et pratique a été développée pour obtenir P. versicolora axenique, fournissant un outil facilement transférable pour d’autres insectes mangeurs de feuilles.

Introduction

Semblable aux mammifères, le tube digestif des insectes est une cavité pour la digestion et l’absorption des aliments. La plupart des insectes abritent diverses bactéries commensales qui se développent dans leurs intestins et vivent de la nutrition fournie par les hôtes¹. La communauté commensale intestinale a un impact profond sur de multiples processus physiologiques chez les insectes, y compris la digestion et la désintoxication des aliments ^2,3,4, la nutrition et le développement ^5,6,7, la défense contre les agents pathogènes et les parasites ^8,9,10,11, la communication chimique^12,13 et les comportements^{14 ,15}. Curieusement, certains microbiotes intestinaux peuvent être facultativement pathogènes ou être manipulés par des agents pathogènes envahisseurs pour aggraver l’infection, ce qui indique que les bactéries intestinales peuvent être nocives dans certains cas 16,17,18. Les bactéries intestinales peuvent également servir de ressource microbienne pour les applications biotechniques et la lutte antiparasitaire. Par exemple, des bactéries digérant la lignocellulose provenant d’insectes phytophages et xylophages ont été utilisées pour digérer les cellules végétales afin de développer des biocarburants¹⁹. La dispersion de symbiotes intestinaux modifiés exprimant des molécules bioactives est une tactique nouvelle et prometteuse pour lutter contre les ravageurs agricoles et forestiers et les moustiques transmettant des maladies infectieuses 19,20,21, qui peut également être utilisée pour améliorer l’aptitude des insectes utiles ²². Illustrer comment une bactérie intestinale se comporte in vivo est donc considéré comme une priorité pour tirer pleinement parti de sa fonction et l’exploiter davantage pour diverses applications.

Les animaux peuvent abriter de 1 à > 1000 espèces microbiennes symbiotiques dans l’intestin¹. En conséquence, il est difficile de vérifier avec précision comment les taxons bactériens individuels ou leur assemblage se comportent à l’intérieur d’un animal, et si l’hôte ou ses partenaires microbiens déterminent une fonction spécifique. Par conséquent, la préparation de larves axeniques pour obtenir des insectes gnotobiotiques par colonisation mono- ou multi-espèces est nécessaire pour étudier la fonction bactérienne et l’interaction avec les insectes²³. À l’heure actuelle, l’administration de cocktails antibiotiques et la stérilisation de la surface des œufs d’insectes sont des méthodes courantes pour éliminer les bactéries intestinales ^14,24,25,26. Cependant, les régimes antibiotiques ne peuvent pas éliminer complètement les bactéries intestinales et ont un effet négatif sur la physiologie de l’insecte hôte^27,28. Par conséquent, l’utilisation d’insectes traités aux antibiotiques peut obscurcir les véritables capacités de certaines bactéries intestinales. Heureusement, la stérilisation de surface des œufs peut annuler ce problème^23,29, qui n’a pas ou peu d’effets sur les insectes expérimentaux. En outre, les régimes artificiels ne peuvent pas ressembler pleinement aux aliments naturels pour insectes, et le développement d’un régime artificiel est un processus coûteux et laborieux^30,31.

Le coléoptère du saule, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), est un ravageur répandu qui mange les feuilles et se nourrit principalement d’arbres saplicacés, tels que les saules (Salix) et le peuplier (Populus L.) ^32,33. Ici, le dendroctone du saule a été utilisé comme insecte mangeur de feuilles représentatif pour développer un protocole de préparation et d’élevage d’un insecte sans germes. Nous avons exploité la culture de tissus végétaux pour obtenir des feuilles de peuplier exemptes de germes pour élever des larves de P. versicolora axenic à partir d’œufs stérilisés. Le statut axenique des larves de P. versicolora a été vérifié par des tests dépendants de la culture et indépendants de la culture. Ce protocole peut maintenir des insectes axeniques qui imitent mieux la condition sauvage que l’élevage d’insectes avec un régime artificiel. Plus important encore, cette méthode est pratique à un coût très faible, ce qui augmente la faisabilité de l’obtention d’insectes axeniques pour de futures études d’interaction insecte-intestin, en particulier pour les insectes non modèles sans régime artificiel bien développé.

Protocol

1. Élevage d’insectes Maintenir la population de P. versicolora dans une chambre de croissance à l’état de 27 °C et 70 ± 5 % d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité. Placez-les dans des boîtes en plastique perforées avec du papier absorbant humide carrelé et nourrissez-les de branches de peuplier frais. Vaporisez de l’eau propre sur du papier absorbant pour maintenir l’humidité et changez les branches tous les deux jours.</l…

Representative Results

Les étapes de la vie de P. versicolora sont illustrées à la figure 1. Le mâle adulte est plus petit que la femelle adulte (figure 1A). Dans le champ, le coléoptère regroupe ses œufs sur une feuille; ici, quatre œufs ont été détachés d’une feuille (figure 1B). Les segments de tiges de peuplier et les semis utilisés pour l’élevage d’insectes hacheniques sont illustrés à la figure 2</…

Discussion

La préparation de larves exemptes de germes et l’obtention de larves gnotobiotiques en réintroduisant des souches bactériennes spécifiques sont des méthodes puissantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions hôte-microbe. Les larves nouvellement écloses obtiennent le microbiote intestinal de deux manières principales: la transmission verticale de la mère à la progéniture ou l’acquisition horizontale par les frères et sœurs et l’environnement³⁴. Le premier pe…

Materials

0.22 µm syringe filters	Millipore	SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution			a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sangon Biotech	F600620
10x PBS stock solution	Biosharp Life Sciences	BL302A
2 M KOH solution			Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers	Shubo	sb16455
50 mL sterile syringes	Jinta	JT0125789
500 mL measuring cylinder	Shubo	sb1601
50x TAE stock solution			a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol	Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)	Solarbio Life Sciences	86-87-3
Absorbing paper			22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar	Coolaber	9002-18-0
Agarose	Biowest	111860
Autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer	Jing Xin	XM-GTL64
DNA extraction kit	MP Biomedicals	116560200
EDTA	Saiguo Biotech	1340
Filter paper	Jiaojie		70 mm diameter
Gel electrophoresis unit	Bio-rad	164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye	TsingKe	TSJ003
Germ-free poplar seedlings			Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×)	TsingKe	TSE101
Growth chamber	Ruihua	HP400GS-C
LB agar medium			a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge	DRAGONLAB	D1008
MS basic medium	Coolaber	PM1121-50L	M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture			a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Paintbrush			1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm	Bemis	PM-996
PCR Thermal Cyclers	Eppendorf	6331000076
Petri dishes	Supin		90 mm diameter
pH meter	METTLER TOLEDO	FE20
Pipettes 0.2-2 µL	Gilson	ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL	Eppendorf	3120000267
Pipettes 20-200 µL	Eppendorf	3120000259
Pipettes 2-20 µL	Eppendorf	3120000232
Plant tissue culture container	Chembase	ZP21	240 mL
Plastic box			2.35 L
Potassium hydroxide (KOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene	Sangon Biotech		27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH)	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls		0.25 mm	used to grind tissues
Stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker	Transgene Biotech	BM121-01
Tris base	Biosharp Life Sciences	1115
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0037
UV transilluminator	Monad Biotech	QuickGel 6100
Vortexer	Scilogex	MX-S
Willow branches			Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle			Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract	Thermo Fisher Scientific	LP0021