잎 딱정벌레의 숙주 - 장 microbiota 상호 작용 연구를위한 조직 배양 묘목으로 축 곤충 준비 및 사육
Summary
도끼 곤충을 얻기 위해 달걀 표면을 살균하고 부화 한 유충은 도끼 잎을 사용하여 사육됩니다. 이 방법은 항생제를 투여하거나 다른 잎을 먹는 곤충에도 적용 할 수있는 인공 식단을 개발하지 않고도 축산 곤충 준비를위한 효율적인 방법을 제공합니다.
Abstract
곤충 내장은 숙주의 생리적 특성에 심각한 영향을 줄 수있는 다양한 박테리아에 의해 식민지화됩니다. 특정 박테리아 균주를 축삭 곤충에 도입하는 것은 장내 미생물 기능을 검증하고 장내 미생물 – 숙주 상호 작용의 기초가되는 메커니즘을 밝히는 강력한 방법입니다. 항생제를 투여하거나 달걀 표면을 살균하는 것은 곤충에서 장내 박테리아를 제거하는 데 일반적으로 사용되는 두 가지 방법입니다. 그러나 곤충에 대한 항생제의 잠재적 인 부작용 외에도 이전 연구에 따르면 항생제를 먹이면 장내 박테리아를 제거 할 수 없다는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 세균이없는 인공 식단은 일반적으로 도끼 곤충을 유지하기 위해 사용되며, 이는 자연 식품의 영양 성분과 완전히 닮을 수없는 지루하고 노동 집약적 인 과정입니다. 여기에 설명 된 것은 잎 딱정벌레 (Plagiodera versicolora)의 축삭 유충을 준비하고 유지하기위한 효율적이고 간단한 프로토콜입니다. 특히, 딱정벌레 알의 표면은 멸균되었고, 그 다음에 세균이없는 포플러 잎이 도끼 유충을 후방하는 데 사용되었습니다. 곤충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 추가로 확인되었다. 종합적으로, 계란 소독과 무균 재배를 결합함으로써, 축삭 P. versicolora를 얻기 위해 효율적이고 편리한 방법이 개발되어 다른 잎을 먹는 곤충에게 쉽게 옮길 수있는 도구를 제공했습니다.
Introduction
포유류와 마찬가지로, 곤충 소화관은 음식 소화 및 흡수를위한 공동입니다. 대부분의 곤충은 내장에서 번성하고 숙주1이 제공하는 영양에 따라 사는 다양한 공생 박테리아를 가지고 있습니다. 장내 공생 공동체는 음식 소화 및 해독 2,3,4, 영양 및 개발 5,6,7, 병원균 및 기생충에 대한 방어 8,9,10,11, 화학 통신 12,13 및 행동 14를 포함하여 곤충의 여러 생리 과정에 중대한 영향을 미칩니다. ,15. 흥미롭게도, 일부 장내 미생물은 병원성이거나 병원균을 침범하여 감염을 악화시킴으로써 조작 될 수 있으며, 이는 장내 박테리아가 어떤 경우에는 해로울 수 있음을 나타냅니다16,17,18. 장내 박테리아는 또한 생명 공학 응용 및 해충 관리를위한 미생물 자원 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식물과 자일로파고우스 곤충으로부터의 리그노셀룰로오스-소화 박테리아는 바이오 연료(19)를 개발하기 위해 식물 세포를 소화하는데 사용되었다. 생리 활성 분자를 발현하는 조작 된 장 공생 물질의 분산은 유익한 곤충22의 적합성을 향상시키는 데 사용될 수있는 전염병 19,20,21을 전염시키는 농업 및 임업 해충 및 모기를 관리하기위한 새롭고 유망한 전술입니다. 따라서 장내 박테리아가 생체 내에서 어떻게 행동하는지 보여주는 것은 그 기능을 완전히 활용하고 다양한 응용 분야에 더 많이 활용하는 우선 순위로 간주됩니다.
동물은 장 1에 1 ~ >1000 종의 공생 미생물 종을 보유 할 수있습니다. 결과적으로, 개별 박테리아 탁사 또는 그들의 조립이 동물 내부에서 어떻게 수행되는지, 그리고 숙주 또는 그 미생물 파트너가 특정 기능을 구동하는지 여부를 정확하게 검증하는 것은 어렵다. 따라서 박테리아 기능과 곤충23과의 상호 작용을 조사하기 위해서는 모노 – 또는 다종 식민지화에 의해 gnotobiotic 곤충을 얻기 위해 축산 유충을 준비하는 것이 필요합니다. 현재 항생제 칵테일을 투여하고 곤충 알의 표면을 살균하는 것은 장내 박테리아14,24,25,26을 제거하는 일반적인 방법입니다. 그러나 항생제 식단은 장내 박테리아를 완전히 제거 할 수 없으며 숙주 곤충 생리학27,28에 부정적인 영향을 미칩니다. 결과적으로, 항생제 처리 곤충의 사용은 일부 장내 박테리아의 진정한 능력을 흐릴 수 있습니다. 다행히도 계란의 표면 살균은이 문제23,29를 무효화 할 수 있으며, 실험 곤충에는 아무런 영향을 미치지 않거나 무시할 수 있습니다. 또한, 인공 식단은 천연 곤충 식품과 완전히 유사 할 수 없으며, 인공 식단을 개발하는 것은 비용이 많이 들고 노동 소모적 인 과정30,31입니다.
버드 나무 잎 딱정벌레 인 Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera : Chrysomelidae)는 버드 나무 (Salix)와 포플러 (Populus L.)와 같은 소금기가있는 나무를 주로 먹는 광범위한 잎 먹는 해충입니다. 32,33. 여기서, 버드나무 잎 딱정벌레는 세균이 없는 곤충을 제조하고 후방하기 위한 프로토콜을 개발하기 위해 대표적인 잎을 먹는 곤충으로 사용되었다. 우리는 식물 조직 배양을 활용하여 멸균 된 알에서 P. versicolora axenic 유충을 후방으로 옮기기 위해 세균이없는 포플러 잎을 얻었습니다. P. versicolora 유충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 검증되었다. 이 프로토콜은 인공 식단으로 곤충을 기르는 것보다 야생 상태를 더 잘 모방 한 도끼 곤충을 유지할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 방법은 매우 저렴한 비용으로 편리하며, 이는 미래의 곤충 – 장내 미생물 상호 작용 연구, 특히 잘 발달 된 인공 식단이없는 비 모델 곤충의 경우 축삭 곤충을 얻을 수있는 가능성을 높입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균이 없는 유충을 제조하고 특정 박테리아 균주를 재도입하여 gnotobiotic 유충을 얻는 것은 숙주-미생물 상호작용의 기초가 되는 기전을 밝히는 강력한 방법이다. 새로 부화 한 유충은 두 가지 주요 방법으로 장내 미생물을 얻습니다 : 어머니로부터 자손으로의 수직 전달 또는 형제 자매와 환경으로부터의 수평 획득34. 전자는 난자 표면(35)의 오염을 통해 자손?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31971663)과 CAST (2020QNRC001)의 젊은 엘리트 과학자 후원 프로그램이 자금을 지원했습니다.
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
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| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
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| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
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